杠柳次苷的主要应用

背景及概述^[1-3]

香加皮PeriplocaeCortex为萝藦科植物杠柳PeriplocasepiumBge.的干燥根皮，具有利水消肿、祛风湿、强筋骨的功能。临床多用于治疗下肢浮肿、心悸气短、风寒湿痹、腰膝酸软等症状。其中，杠柳毒苷是存在于香加皮中的一类甲型强心苷类成分，具有强心利尿、抗肿瘤、抗炎、疫调节等药理作用。杠柳毒苷、杠柳次苷及杠柳苷元与其他甲型强心苷类成分一样可以选择性作用于心脏，有加强正性肌力的作用，可以增加心肌收缩力，减慢心率，是香加皮的主要药效成分。并且相比于洋地黄毒苷和地高辛等强心苷类成分，其治疗窗较宽，但过量使用仍然会导致临床用药危险，例如产生房室传导阻滞、早搏、心动过速、心房颤动等心脏毒性。

柳毒苷结构为杠柳苷元-(D-加拿大麻糖)-(D-葡萄糖)。杠柳次苷结构为杠柳苷元-(D-加拿大麻糖)，是由杠柳毒苷脱去一分子葡萄糖而生成的次生甲型强心苷。通常甲型强心苷及其苷元的活性/毒性存在如下规律：苷元＜单糖苷＞二糖苷＞三糖苷。杠柳次苷为单糖苷，其活性/毒性之所以大于杠柳苷元，是由于其对心肌细胞膜上类脂质的亲和力大于苷元；而杠柳毒苷(二糖苷)的活性/毒性之所以小于杠柳次苷，是由于随着这些分子中糖基数目的增加，水溶性增大，亲脂性降低，与心肌细胞膜上类脂质的亲和力减弱，强心作用减小。对杠柳次苷进行制备，有利于明确中药香加皮强心物质基础的研究，以及利于该中药的进一步开发。默克索引(14版，第1239页)提到过杠柳次苷的酶解制备方法：用70％乙醇提取希腊杠柳，然后用源自StrophanthuscourmontiSaclcux，Apocynaceae种子的毒毛旋花子双糖酶(enzymestrophanthobiase)处理，然而其中并未提及杠柳毒苷酶解的具体工艺以及工艺效果例如杠柳次苷的收率、纯度等。因此提供一种稳定、可靠、低毒、和/或可用于工业化生产的制备杠柳次苷的方法，获得高纯度的杠柳次苷，以供新药研发或科学研究，仍是本领域技术人员急于解决的问题。

应用^[1]

文献报道杠柳次苷具有比杠柳毒苷强心作用更快、持续时间更短、蓄积作用更小等特点。另外，研究发现杠柳毒苷与大鼠、人体的肠菌温孵，会迅速代谢生成杠柳次苷；大鼠口服杠柳毒苷，粪便中也主要以杠柳次苷的形式排泄。因此，杠柳次苷也应是香加皮起强心作用的主要成分之一。

制备^[1]

(1)酶解：取香加皮提取物(含10％杠柳毒苷)6.5g，底物(按杠柳毒苷计)与蜗牛酶10∶1(w/w)混合，加入pH5.5的醋酸盐缓冲液25mL，38℃下温孵，12h后加甲醇终止酶促反应，用乙酸乙酯萃取3次，每次90mL，合并乙酸乙酯层，浓缩干燥，得酶解粗提物2.3g。

(2)柱层析：称酶解粗提物2.1g，加无水乙醇溶解样品，按粗提物：硅胶1∶2(w/w)的比例加硅胶拌样，上硅胶柱，以乙酸乙酯-石油醚(2∶1)为洗脱剂，每20mL为一份，收集经TLC检测呈较深紫红色斑点的流份(展开剂为氯仿-甲醇-水65∶35∶10，显色剂3，5-二硝基苯甲酸试液)，合并30～80份，回收溶剂，减压真空干燥，得精制提取物0.8g。

(3)重结晶：取精制提取物0.8g，加甲醇使溶解，加水适量，于4℃静置12h以上，析出白色结晶，以50％甲醇洗涤结晶，减压干燥，得白色结晶0.4g。三个步骤的总收率约92.3％。

(4)结构与纯度检测：对步骤(3)所得白色结晶进行结构确认：

A.紫外UV扫描：在218nm处有吸收峰，具有Δα，β五元内酯环的强心苷特征吸收。

B.红外IR分析：在3600～3200cm-1处有典型的羟基吸收峰，在1782，1741和1631的吸收显示为β-取代-Δα，β-γ-内酯的吸收峰。C.核磁NMR分析：NMRδH：0.883H(s)，0.933H(s)，3.303H(s)，4.151H(m)，4.902H(s)，5.901H(s)，说明母核为杠柳苷元。NMRδH：4.82dd，2.20ddd，3.61q，3.2dd，3.44dq，1.22dd，NMRδC：96.79，34.44，77.72，72.94，70.12，17.22，56.73说明有加拿大麻糖的存在。D.质谱MS分析：m/z：535.3[M+H]+，552.4[M+NH4]+，391.2[M-C6H8O4]+，373.3[M-C6H8O4-H2O]+，355.3[M-C6H8O4-2H2O]+，337.3[M-C6H8O4-3H2O]+，推算该化合物的分子式为C30H46O8。

经分析确认为杠柳次苷。

(5)对步骤(3)所得白色结晶进行纯度分析：

A.TLC：在高效硅胶板上点样2μg～100μg，氯仿∶甲醇∶水＝13∶3∶2下层展开，用3，5-二硝基苯甲酸/5％NaOH醇液或10％硫酸乙醇显色，只见单一紫红色/黑色斑点。

B.HPLC(PDA检测器)：用二极管阵列检测器进行60min色谱及200nm～400nm光谱图采集，除溶剂峰外仅见一单峰，用光谱进行该峰峰纯度检查，提示为单一化合物。经检测制备的杠柳次苷纯度为98％，并且未检测到杠柳毒苷。

主要参考资料

[1] CN201010583339.0一种杠柳次苷的制备方法

[2] 杠柳毒苷、杠柳次苷及杠柳苷元生物药剂学分类研究

[3] 天然药物化学成分提取分离手册