谷氨酸氧化酶的应用

发布日期:2020/10/26 11:48:35

概述^[1]

谷氨酸氧化酶（ L-glutamate oxidase，GLOD）是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）为辅酶的L-氨基酸氧化酶，能在不添加外源性辅助因子的条件下氧化L-谷氨酸脱氨，生成α-酮戊二酸、氨和过氧化氢。谷氨酸氧化酶对反应底物具有高特异性和高亲和力，反应条件温和，催化效率高，在食品、工业发酵及医药行业有广泛的应用。该酶自20世纪80年代发现以来，一直是国内外的研究热点，是潜在的工具酶之一。

来源^[1]

L-氨基酸氧化酶来源丰富，在蛇毒液、许多动物和微生物中均能分离到，微生物来源较为广泛，但是其产酶能力均不高。现研究阶段，谷氨酸氧化酶多是从微生物中分离得到，其中链霉菌类产酶能力相比较其他菌种较强，其酶产量达到6.4 U/mL。

近年来，国内外科学家分别从土壤中分离出了能产谷氨酸氧化酶的放线菌、链霉菌，完善了该酶发酵产酶体系，分离得到粗酶液，酶学性质研究表明，能高度专一分解L-谷氨酸生成氨、α-酮戊二酸和过氧化氢。综上所述，自然界中产谷氨酸氧化酶的菌株很多，主要筛选到的菌株是放线菌及链霉菌。研究显示链霉菌产酶能力较好，更适合应用于工业生产。现阶段的研究方向主要是对该酶基因进行克隆并进行表达，提高其产酶能力，为更加广泛地应用提供基础。

应用^[1]

1 在生物传感器上的应用

L-谷氨酸在医药、食品添加剂、营养强化剂等领域具有十分广泛的作用，但是其人均日允许摄入量不超6 g/d，食用过量L-谷氨酸会出现十分明显的中毒症状，表现在头痛、眩晕及脸部大量出汗等。因此对于食品及临床样品中L-谷氨酸含量的检测是十分重要且必要的。 L-谷氨酸常用的传统检测方法有电位滴定、华勃氏呼吸测定法和色谱分析等，这些方法耗时耗力还需要高端精密设备。因此考虑应用生物传感器来检测L-谷氨酸，生物传感器具有快速、灵敏度高、设备简单等优点。

测定L-谷氨酸的生物传感器常采用谷氨酸氧化酶、谷氨酸脱羧酶及谷氨酸脱氢酶作为酶膜。谷氨酸氧化酶具有高度底物特异性，且不存在可逆反应等其他两种酶不具有的优势，因此广泛应用于生物传感器，用于测定食品及临床样品中L-谷氨酸的含量及其偶联反应。

2 在测定转氨酶活性上的应用

临床医学上检验肝功能的重要指标是肝脏细胞中谷草转氨酶（ aspartate transaminase，AST）与谷丙转氨酶（alanineaminotransferase，ALT）的含量，作用反应方程式为：

检测其含量与活性的常规方法是丙酮酸氧化酶法和赖氏法。谷氨酸氧化酶对L-谷氨酸具有高度底物特异性，而谷草转氨酶（AST）与谷丙转氨酶（ALT）与底物反应会产生L-谷氨酸，因此将两个反应偶联用于测定谷草转氨酶（AST）与谷丙转氨酶（ALT）的活性与含量。

3 在测定肌酐上的应用

血肌酐的含量是临床用于检测肾功能的参数之一。肌氨酸氧化酶法和碱性苦味酸法常用于测定肌酐的含量，测定反应方程式为：

1993年，RUI C S等利用谷氨酸氧化酶创立了流动注射系统测定血肌酐的含量。其特色性的采用双通路测定来避免血液中内源性谷氨酸和氨对测定的影响。响应为内源性氨谷氨酸和肌酸酐的总和响应；第二响应为内源性氨和谷氨酸的响应，其测量范围分别达到为2 mmol/L和3 mmol/L。该系统具备良好的稳定性和重现性，与化学方法获得的化验结果中肌酐的含量呈良好的相关性。

克隆表达^[1]

谷氨酸氧化酶距工业化发酵生产还有很大的距离，很大程度上限制了其应用。因此需要进一步提高其产酶能力，充分发挥菌株的生产能力，显著提高发酵产量。谷氨酸氧化酶研究至今，国内外所见报道中谷氨酸氧化酶产酶能力均不强，极大的限制了其应用，因此采用基因工程的方法构建工程菌来提高产酶能力是十分重要且常见的手段。2001年，CHENCY等对灰色链霉菌（Streptomyces platensis） NTU3304的谷氨酸氧化酶基因进行了克隆研究，他们将产酶基因克隆重组在变铅青链霉菌中。

研究结果显示，该产酶基因全长2 130 bp，由710个密码子组成，前体分子质量大小为78 ku，成熟后分子质量大小为76 ku，由三个亚基组成。2013年，卢婵等将Streptomyces sp.X-119-6的谷氨酸氧化酶基因克隆重组，并在原核表达载体大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达。研究结果显示谷氨酸氧化酶比酶活达到1.1 U/mg；而后又进行了3 L发酵罐发酵产酶研究，结果显示重组产酶菌产谷氨酸氧化酶比酶活达到1.61 U/mg。目前，美国Sigma公司已利用基因工程技术，以大肠杆菌为宿主菌构建了产酶工程菌，极大提高了产酶能力和稳定性，并将其应用于商业化生产，为其进一步研究应用创造了条件。