含吡咯烷生物碱中草药的肝毒性及其检测方法

概述

中草药引致肝损伤是当代药物不良反应监测 中特别值得关注的问题[1]。然而，由于中草药成分 繁多且复杂，一般难以开展中草药毒性标志成分的 检测研究。分析众多的中草药毒性成分研究现状， 目前主要明确吡咯烷生物碱(PA)是导致肝小静脉 闭塞病(HVOD)的重要的植物性肝毒性成分[2]。 如果能从这类比较明确的草药肝毒性成分研究入 手，有助于深入阐明中草药的毒性及其现代检测方 法，促进我国中草药肝毒性鉴定研究走向国际前沿。

含PA中草药的肝毒性

PA致肝毒性的机制

PA广泛分布于自然界的多种植物群中，据统 计大约3％的有花植物(共约6 000余种)含有PA， 主要分布于紫草科、菊科、豆科、兰科等。PA多数 由具有双稠吡咯啶环的氨基醇(裂碱)和有机酸(裂 酸)两部分缩合形成。在双稠吡咯啶环的1，2位为 双键的PA，具有肝脏毒性，如野百合碱和千里光 碱。迄今为止已从植物中分离出120余种具有肝毒 性的PA，是目前已知的最重要的植物性肝毒性成 分之一[2|。

摄入含有PA的中草药后，吡咯类生物碱可通 过两条代谢途径在肝脏代谢：一条是通过混合功能 氧化酶系统形成N一氧化物，另一条是通过细胞色素 P450的脱氢作用形成脱氢生物碱或吡咯类物质。 PA本身及其常规水解产物对机体并无毒性，但当 其到达肝脏后。在细胞色素P450的催化下，首先被 氧化为不稳定的脱氢吡咯烷生物碱(DHP)，DHP 可进一步被水解为脱氢裂碱(DHN)。DHP和 DHN具有很强的亲电性，能与肝脏中的大分子如 DNA／RNA等结合而影响蛋白质合成与细胞分裂， 二者可与谷胱甘肽(GSH)或半胱氨酸反应形成毒 性较弱或无毒的产物。当GSH含量减少时，毒性 物质形成增加，从而导致细胞受损[3]。肝小叶第Ⅲ 带肝细胞含有丰富的细胞色素P450，但GSH含量 较低，该区带的窦状隙内皮细胞(SEC)的GSH含量 则更低，由此决定了第Ⅲ带SEC及其肝细胞容易受 到有毒物质的损伤H]。有研究发现，属于PA类的 野百合碱在肝脏通过细胞色素P450代谢成烷化剂 脱氢野百合碱后，抑制了呼吸链复合体I中NADH 脱氢酶的活性，从而引起动物和人的肝脏损伤，该 机制可能与半胱氨酸巯基被代谢产物修饰而引起 的呼吸链复合体I构象的改变有关。

PA的实验检测方法研究现状

目前已有的含PA中草药肝毒性的检测方法包 括体外和体内两种途径。体外途径是从可疑的致 毒性草药中提取总生物碱，再应用液相色谱一质谱 (HPLC／MS)联用等色谱分析方法，测定是否含有PA成分，以期为HVOD诊断提供间接诊断依 据[7]。体内途径是通过检测患者的血液或尿液等生 物样本，应用色谱分析方法分析鉴定血样中的PA 成分及其含量。

在分析PA体内代谢过程中发现，经过肝脏细 胞色素P450代谢生成的DHP和DHN也进入血液 循环，与血浆蛋白半胱氨酸残基的巯基结合。由 于与血浆蛋白结合后可使PA代谢物体内半衰期明 显延长，因此若能发现与PA代谢物作用后的特异 性血浆蛋白改变，则有可能作为检测含PA草药肝 毒性的理想检测标志。近期研究报道[1 5|，将马血液 与PA活性成分野百合碱体外处理后，经蛋白质组 学方法全景式分析发现，马血清蛋白谱中出现一种 高分子量的蛋白质聚合物；再经质谱法分析以及免 疫印迹法(western blotting)检测，确认其主要成分 为纤维蛋白原、血清白蛋白和转铁蛋白，它们与PA 代谢产物交叉结合，形成了高分子量蛋白质聚合 物。检测这种存在于血液中的高分子量蛋白质聚 合物，有可能作为马食用含PA植物的标志性证据。 因此认为，在啮齿类动物以及人体相关疾病状态 中，PA也可以改变血浆蛋白的结合状态，采用蛋白 质组学全景式分析等技术手段，有可能寻找发现其 特异性结构变化，以期作为检测PA的体内生化标 志物。

结语与展望

在我国中草药使用广泛，其肝毒性问题愈发突 出。目前已明确PA是导致HVOD的重要的植物 性肝毒性成分。HVOD缺乏特异性临床表现，影像 学检查虽可提供重要参考信息，但确诊主要依靠肝 穿刺活检。由于患者一般难以接受肝脏活检，因此 需要建立和完善鉴定PA体外和体内检测方法，以 期达到理想的无创伤性检测目的。 体外检测中，判定可疑药物是否含有PA成分， 可以通过各种色谱法、色谱一质谱联用法等方法进行 分析，技术手段已日趋成熟。体内检测中，蛋白质 组学研究方法更具发展前景。借鉴国外报道的马 血液经PA体外处理后的蛋白质组学分析结果，若 能确定与HVOD相关的血浆蛋白质成分结构变化 和(或)表达差异点，则可以为建立敏感、准确的肝 毒性PA体内检测技术奠定基础。

参考文献

1 Seeff LB．Herbal hepatotoxicity．Clin Liver Dis，2007，1 1：577— 596．

2 Zuckerman M，Steenkamp V，Stewart MJ．Hepatic venc-occlu— sire disease as a result of a traditional remedy：confirmation of toxic pyrrolizidine alkaloids as the cause。using an in vitro tech— nique．J Clin Pathol，2002，55：676-679．

3 DeLeve LD，Wang X。Kuhlenkamp JF，et a1．Toxicity of aza— thioprine and monocrotaline in murine sinusoidal endothelial cells and hepatocytes：the role of glutathione and relevance to hepatic venooclusive disease．Hepatology，1996，23：589-599．

4 Valia DC．Budd—Chiari syndrome and venc-occlusive disease／sinusoidal obstruction syndrome．Gut，2008，57：1469-1478．

5 Mingatto FE，Dorta DJ。dos Santos AB。et a1．Dehydromono— crotaline inhibits mitochondrial complex I．A potential mecha— nism accounting for hepatotoxicity of monocrotaline．Toxicon， 2007，50：724-730．