灵芝酸C2的制备

背景及概述^[1][2]

灵芝含有丰富的活性成分，以多糖和属三萜类的灵芝酸为主要活性成分。药理研究显示灵芝多糖具有抗癌、抗肿瘤、免疫调节、抗衰老、抗氧化等作用；灵芝酸C2可抑制肿瘤细胞、艾滋病毒以及细菌。当前灵芝多糖等灵芝活性物质生产主要依赖人工栽培子实体为原料以提取的方法获取，具有产率低、难以规模化生产以及不同批次间活性成分组成及含量有较大差异等缺点。

检测方法^[1]

灵芝酸C2是一类高度氧化的羊毛甾烷衍生物，主要有高效液相色谱法、香草醛-高氯酸比色法和紫外吸收法等3种分析方法。高效液相色谱法的优点在于其可同时分析不同单体灵芝酸含量以及样品制备过程相对简单，但仪器昂贵、不易操作以及试剂要求高；紫外吸收法和香草醛-高氯酸比色法由于所需仪器设备简单成为灵芝酸分析的主要方法。紫外吸收法通常以灵芝酸A和百里酚为灵芝酸对照品以定量分析；香草醛-高氯酸比色法主要以熊果酸和齐墩果酸作为参比物进行分析。但是利用紫外可见光谱分析不同灵芝酸及对照品差异，以不同对照品利用紫外吸收法和香草醛-高氯酸比色法分析灵芝发酵菌丝及子实体灵芝酸含量，是没有的。

灵芝酸C2

制备^[2]

（1）称取灵芝浸膏副产物原料，加一定量的无水乙醇，比例为1:5，超声溶解，溶液离心后取上清液过0.45μm滤膜，得灵芝原液，供中压制备用；

（2）Flash中压制备收集到的液体上HPLC测定，分别得到灵芝酸A、B、C2混合物，水浴蒸干，供高压制备备用；

（3）灵芝酸A、B、C2混合物蒸干后，加入适量甲醇溶解，过膜，滤液进行高压制备纯化，Prep高压制备收集到的液体上HPLC测定，分别得到灵芝酸单体，再进行重结晶，得到灵芝酸纯品。

以下以具体实验为例进行说明：

（1）样品前处理取20g灵芝浸膏副产物研磨，加100mL无水乙醇（或甲醇），超声1h，溶液于7800r·min-1，离心10min。取上清液过0.45μm滤膜，得棕褐色副产物溶解液，备用。

（2）中压制备灵芝酸粗提物Flash中压制备色谱条件：Grace色谱柱C18-WP（40g，20μm）；以乙腈-0.05%醋酸溶液为流动相进行梯度洗脱；Flash模式下色谱条件：流速25mL/min，运行时间10min，紫外检测波长254nm，进样约1.2mL；梯度洗脱程序：乙腈-0.05%醋酸溶液：0～4min：45%乙腈；4～4.01min：45%~55%乙腈；4.01～10min，55%乙腈。收集到的液体上HPLC测定，分别得到灵芝酸A、B、C2混合物，水浴蒸干备用。

（3）高压制备灵芝酸提物灵芝酸A、B、C2混合物蒸干后，加入适量甲醇溶解，过0.45μm滤膜，滤液进行高压制备纯化。Prep高压制备色谱条件：Waters制备色谱柱（SunFireTMPrepC18OBDTM5μm19*150mm）；以乙腈-0.05%醋酸溶液为流动相进行梯度洗脱；Prep模式下色谱条件：流速13mL/min，运行时间43min，平衡时间3min，紫外检测波长254nm，进样约1mL；梯度洗脱程序：乙腈-0.05%醋酸溶液：0～29min：30%乙腈；29～36min：30%～50%乙腈；36～36.1min，50%～90%乙腈；36.1～43min，90%乙腈。收集到的液体上HPLC测定，分别得到灵芝酸A、灵芝酸B和灵芝酸C2，水浴蒸干。重结晶提纯后，经高效液相色谱鉴定，灵芝酸A、灵芝酸B和灵芝酸C2纯度均大于98%。

主要参考资料

[1] 董虹玲, 夏广萍, 赵娜夏, 白秀秀, 邵泽艳, & 韩英梅. (2013). Hplc法测定灵芝子实体和孢子粉中灵芝酸c2,灵芝酸g和灵芝酸a. 现代药物与临床, 28(1), 41-43.

[2] 吴慧慧, 唐珊珊, 周茜, & 陈作红. (2016). 灵芝酸c2对鹅膏毒肽中毒小鼠肝组织细胞凋亡的影响.

[3] 吴禾, 刘晔, & 姜华. (2006). 紫外分光光度法测定灵芝及调脂灵中总灵芝酸的含量. 解放军药学学报, 22(1), 74-76.