人磷酯酶CΓ链(PLCΓ1)ELISA试剂盒说明书

背景^[1-3]

人磷酯酶CΓ链(PLCΓ1)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人磷酯酶Cγ链(PLCγ1)水平。用纯化的人磷酯酶Cγ链(PLCγ1)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中加入磷酯酶Cγ链(PLCγ1)，再与HRP标记的磷酯酶Cγ链(PLCγ1)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的磷酯酶Cγ链(PLCγ1)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人磷酯酶Cγ链(PLCγ1)的浓度。

操作步骤：

1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在、第二孔中分别加标准品100μl，然后在、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为18ng/ml，12ng/ml，6 ng/ml，3 ng/ml，1.5 ng/ml）。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于分泌型磷酯酶A2及神经酰胺诱导的细胞程序化死亡及其相关的信号传导途径研究

探讨了某些脂类活性分子介导的信号传导与分泌型磷脂酶A诱导的细2胞死亡之间的关系。分泌型磷脂酶A能诱导细胞的程序化死亡，并伴随有细胞2内神经酰胺生成的增加。

鞘磷脂对分泌型磷脂酶A的活性起着负2调控作用，它能有效的抑制分泌型磷脂酶A 2对细胞的杀伤作用。相反，鞘磷脂酶则能显著增强分泌型磷脂酶A对细胞的毒性作用。分泌型磷脂酶A和神经酰2 2胺均能抑制缓激肽和佛波酯诱导的磷脂酶D的活性。这些结果显示了细胞内甘油磷脂和鞘磷脂信号途径之间存在的精细调控作用。

此外，还发现分泌型磷脂酶A能下调表皮生长因子受体的活化，它能明显的抑制表皮生长因子诱导2的受体自身磷酸化，并抑制表皮生长因子诱导的磷脂酶D活性和磷脂酶C-g的1酪氨酸磷酸化。

在相同的条件下，分泌型磷脂酶A亦能诱导细胞内神经酰胺生2成的增加；外源性的神经酰胺类似物也能有效的抑制表皮生长因子诱导的这些生物事件，提示神经酰胺在分泌型磷脂酶A所介导的细胞死亡和信号传导事件2中起着重要的作用。

参考文献

[1]Murakami M,Shimkara S,Kambe T,et al.Journal of Biological Chemistry.1998

[2]Nevalainen TJ.Clinical Chemistry.1993

[3]Tischield JA.Journal of Biological Chemistry.1997

[4]Gilbert JJ,Stewart A,Courtney CA,et al.J Immunol.1996

[5]赵晟.分泌型磷酯酶A_2及神经酰胺诱导的细胞程序化死亡及其相关的信号传导途径[D].中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）,2002.