病理技术探讨—— 苏木素—伊红染色

苏木素是从洋苏木中提取的一种染色剂，它在被氧化后生成苏木精，易溶于酒精和甘油，较难溶于水，需加热才能溶解。这是一种永久染色剂。其他常用的含有苏木素的染色剂有磷钨酸苏木素染色剂，也就是磷钨酸与苏木素的混合物，苏木素染色剂经常为组织的研究使用。

染色及染色的方法在我国公元前就发展的相当普遍，劳动人民首先发明了织物的染色方法，所用的染料是从动物、植物、矿物质中提炼出来的。由于受到纺织物品染色技术的影响，推动了生物学、组织学和形态学化学染色方法和技术的发展。任何组织的切片，如果不进行染色，看不到组织的细微结构，看不到细胞核，更无法分辨出肿瘤的良恶性，不能向临床医师提供诊断依据，更不能为病人的正确治疗提供方案。所以染色在病理组织形态学的诊断、科学实验研究以及教学工作中具有重要的意义和实用价值。
科学的进步和质量控制的需要，现市场有多家提供商品化的各种成品染色试剂，已被各大医院病理科和实验室所接受。但是，我们的病理技术人员也要必须掌握各种试剂的配制和染色原理，否则，难以制出合格的病理切片。

苏木素染色原理及配制方法

一、苏木素来源及染色原理

苏木素是一种天然染料，是从苏木素树（Haematoxylin Compechianum）的树心木提炼出来的。它原产于墨西哥的坎佩切（Campeche），因此而得名。它多生长在西印度群岛，虽然使用年限较早，但是着色性能一直很差。直到70年代苏木素有了新的提取方法，是将苏木树锯倒后剥去外皮，将树心木先用热水浸泡，再加尿素沉淀（Lamb，1974）后制成的染料才比较稳定。自从有苏木素以来，苏木素在单独使用时着色能力很差，但仍然是最常用的染细胞核的组织学染料。为了获得的苏木素染色液必须具备以下两个条件：一是必须能产生有效成分苏木因（Haematein）；二是染色时需要加适量的媒染剂（如硫酸铝钾、氯化铁及硫酸铁胺等）。
苏木因是由苏木素氧化而产生的，是按传统的方法暴露于阳光和空气之下，叫做熟化，需要3—4个月的时间。如用氧化剂使之快速成熟也可得到较好的结果，但是使用寿命不如自然氧化的苏木素。
苏木素所以被称为染料是因为苏木素的分子氧化后成为生物染料——氧化苏木红。在常规苏木素伊红染色中，苏木素经过氧化变成酸性染料苏木红，苏木红与二价或三价的金属盐或氢氧化物结合形成带正电荷的蓝色色精，只有在这种情况下才能与细胞中带负电荷的脱氧核糖核酸结合完成染色。苏木红和媒染剂的结合不但较好地显示细胞核成分，还可与组织中的其他物质进行结合。
苏木素呈淡黄色，用人工氧化的方法可以快速全部地将苏木素变成苏木红。但如果过氧化就会破坏染料的分子结构影响染色力。

二、苏木素染色液的配制

1.Harris苏木素液
苏木素2.5g，
无水乙醇25ml，
硫酸铝钾50g，
蒸馏水500ml，
氧化汞1.25g，
冰乙酸20 ml。

[配制方法]
A液：将苏木素溶于无水乙醇中，加热至完全溶解。B液：将硫酸铝钾溶于蒸馏水加热溶解；A液倒入B液中加热使溶液尽快沸腾，去火缓慢加入氧化汞，防止溶液溢出。然后再煮沸1—2分钟，立即浸入冷水冷却后备用。临用时加入冰乙酸过滤即可。

[注意事项]
(1)加热的A液倒入加热的B液中，防止液体喷出，应缓慢分多次倒入，禁止在明火上操作。
(2)加氧化汞时要少量地缓慢加入。防止多量快速地加入氧化汞，避免液体溢出，也可将氧化汞溶解于10ml水中慢慢加入。
(3)氧化汞加入后煮沸时间不要过长，防止过度氧化。
(4)氧化汞如潮解有颗粒要用药勺背压碎成粉末状加入。
(5)如需自然氧化的苏木素不加氧化汞，三个月以后用时加入20ml冰乙酸过滤后即可应用。
(6)用于配液烧瓶要大于配制试剂量的一倍以上为宜。

2.Harris改良苏木素液配制方法
苏木素 2.5g
无水乙醇 25 ml
硫酸铝钾 17g
蒸馏水 500 ml
氧化汞 0.5g
冰乙酸 5ml

[配制方法]
用烧瓶将苏木素溶于无水乙醇中，水温加热至完全溶解。再用大的烧瓶取500ml蒸馏水加热至85℃时放入硫酸铝钾，待完全溶解后再加热至91℃，然后慢慢倒入溶解的苏木素乙醇液，让溶液温度保持在89℃—91℃之间再慢慢加入氧化汞，充分搅拌均匀持续1—2分钟后迅速入水冷却。临用时加冰乙酸即可。

[注意事项]
(1)溶解硫酸铝钾不要温度过高和长时间煮沸（硫酸铝钾是碱式盐，温度过高或时间过长会造成碱式盐分解，金属铝析生成为氢氧化铝易产生混浊）。
(2)将氧化汞溶解于10ml水中慢慢加入较为安全。
(3)整个配制过程用水浴加温容易控制温度。

3.无汞苏木素液配制方法
苏木素 10g
无水乙醇200ml
硫酸铝钾60g
蒸馏水2200ml
1%高碘酸80ml
将苏木素溶于无水乙醇，稍加热溶解。硫酸铝钾溶于蒸馏水中，加热至完全溶解。再将苏木素乙醇液倒入。加入1%高碘酸，迅速冷却后过滤即可应用。

伊红的染色原理及配制方法

一、伊红的染色原理
伊红是一种酸性胞浆性染料，而胞浆的染色与PH值有着密切的关系，它们均是带负电荷的。在染液中加入适量冰乙酸使细胞浆带正电荷（阳离子），就可以被带负电荷（阴离子）的染料染色。伊红是一种化学合成的酸性染料，在水中分解成带负电荷的阴离子与蛋白质的氨基正电荷（阳离子）结合而成使细胞胞浆、红细胞、肌肉组织、嗜伊红颗粒、结缔组织等被染成不同程度红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明的对比，所以伊红是染细胞浆的染料。

二、伊红染液的配制
1.水溶性伊红液
伊红Y(水溶性)1ɡ
蒸馏水100ml
伊红Y溶于少许蒸馏水中，用玻璃棒搅拌溶解后，加蒸馏水至100ml。

2.醇溶性伊红液
伊红Y（纯溶性）1ɡ
95% 乙醇
伊红Y（纯溶性）溶于少量95% 乙醇中，用玻璃棒搅拌彻底溶解后，95%乙醇补足100ml。

3.水溶性伊红乙醇液
伊红Y(水溶性)1ɡ
蒸馏水75ml
95%乙醇25ml
伊红Y溶于少许蒸馏水中，用玻璃棒搅拌溶解后加入剩余蒸馏水，再加95%乙醇。

4.沉淀酸化伊红Y乙醇液
伊红Y20g
蒸馏水500ml
伊红Y用蒸馏水充分溶解加浓盐酸10ml，搅拌均匀，放置过夜，析出沉淀。用滤纸过滤，滤液不要，沉淀物与滤纸一起放恒温箱干燥，用95%乙醇1000ml配成沉淀酸化伊红Y乙醇储存液。
临用时，取饱和液1份，加95%乙醇2份，配成工作液。

5．SIGMA伊红水溶液
伊红1g
蒸馏水100ml
伊红放入蒸馏水中迅速震荡溶解后不用过滤，可以立即使用。

苏木素伊红染色的分化控制与返蓝

一、分化的目的与控制
苏木素染色水洗后必须进行分化处理。分化就是用某些试剂（1%的盐酸酒精液），因酸能破坏苏木素的醌型结构，促使色素与组织解离，将细胞核中结合过多的染料和细胞浆中吸附的染料及不需要着色的部位去除掉，以利于伊红的染色，这个过程称为分化。
分化不管是使用手工控制或用机染控制要根据分化液的新鲜程度来决定分化时间。如果是新鲜配制的分化液分化时间要短一些，反之分化时间就要长一些；苏木素染色时间久分化的时间要长一些，反之分化时间就要短一些。分化一定要使细胞核、核仁及染色质清晰可见，必须在显微镜下控制分化，分化不可过度，分化适宜后迅速放入自来水冲洗去除酸后而中止分化。

二、返蓝的目的与控制
苏木素染色后经1℅盐酸酒精液分化;切片是在酸性环境中,这时颜色是红褐色。切片进入弱碱性自来水冲洗或用返蓝液（0.5%氢氧化氨水溶液）在碱性环境中就会由红褐色变成蓝色。这是因为染料苏木红加铝，形成的蓝色色精在酸性环境中处于离子状态，此时为红色。在碱性环境中处于结合状态，呈蓝色。

三、分化液、返蓝液的配制
1.分化液
浓盐酸1ml
70%乙醇99ml
2.返蓝液
氢氧化氨0.5ml
蒸馏水99.5ml

苏木素伊红染色手工操作程序及注意事项

自从有组织学切片制作及染色的技术以来，苏木素-伊红的染色方法程序多少年来一直采用手工操作的方法来完成。
苏木素伊红染色手工操作方法可以对不同的组织进行不同程度的染色时间，特别是对细胞核多的淋巴结组织及腺体等组织染色后分化时间要比正常组织长些，直到显微镜下控制满意为止。
苏木素伊红染色手工操作完全靠经验，靠工作的责任心，才能达到满意的染色结果。

一、染色程序
1．切片入二甲苯I脱蜡 5分钟
2．二甲苯II脱蜡 5分钟
3．二甲苯III脱蜡 5分钟
4．无水乙醇I 1分钟
5．无水乙醇II 30秒
6．95％ 乙醇 30秒
7．85％乙醇 30秒
8． 75％乙醇 30秒
9．自来水冲洗
10．苏木素染液 5－10分钟
11．自来水冲洗
12．1％盐酸酒精分化数秒（镜下控制）
13．自来水冲洗
14．0.5％氨水返兰数秒
15．自来水冲洗1分钟，镜下控制细胞核分化程度
16．1％伊红水溶液1－3分钟
17．适度自来水洗
18．85％乙醇脱水10秒
19．95％乙醇脱水10秒
20．95％乙醇脱水10秒
21．无水乙醇I脱水30秒
22．无水乙醇II脱水30秒
23．无水乙醇III脱水1分钟
24．二甲苯I透明1分钟
25．二甲苯II透明1分钟
26．二甲苯III透明1分钟
27．中性树胶封固

二、染色注意事项
1．脱蜡要彻底，时间宁长勿短。脱蜡彻底的切片呈透明状，如有白色呈云雾状为脱蜡不干净。脱蜡彻底与否取决于环境温度、切片温度、二甲苯脱蜡使用的时间及脱蜡片数来决定。
2．二甲苯的容器要密闭，严禁液体外溢，避免或减少二甲苯对人体的毒害，必须在通风柜橱中进行操作。
3．苏木素-伊红的染色时间应根据组织不同、组织新旧、固定液不同、固定时间、环境温度、染色液新旧、切片厚薄及染片数量来决定。淋巴结等细胞核密集的组织应缩短染色时间，而脑、肌肉、心肌等胞浆占比例较大的组织则要延长染色时间。新鲜组织易着色，陈旧组织较难着色，甚至不着色。
4．染色后不宜在水中停留时间过长，防止染色质变蓝后不易分化；伊红染色后水洗时间要短，否则易脱色。整个过程要在显微镜下观察控制染色效果。
5．H、E的染色成败关键在于盐酸酒精分化及返兰，一定要在镜下控制，
严格掌握时间。进行分化时，肉眼观察组织切片由原来的深蓝色变为红
色至粉红色时即恰到好处，再冲水返蓝。
6．切片脱水时在低浓度酒精时间不宜过长，对伊红有分色及退色作用。在无水乙醇脱水时间应稍长，保证最后一步酒精要纯，防止将水份带入二甲苯。二甲苯后两步宜慢，以利于无水乙醇彻底脱净，封片后如切片呈云雾状，说明最后一步二甲苯不纯。

（本文作者：北京协和医院王德田教授， 摘自《实用现代病理学技术》精装，中国协和医科大学出版社。本文已授权，如要转载请注明转自“优纳科技微信平台”）