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几种常见荧光素极其特性介绍

发布日期:2020/11/20 15:08:01

荧光素(英语:Fluorescein,又称为荧光黄)是一种合成有机化合物,它是具有光致荧光特性的染料,外观为暗橙色/红色粉末,可溶于乙醇,微溶于水,在蓝光或紫外线照射下,发出绿色荧光。荧光染料种类很多,目前常用于标记抗体的荧光素有以下几种:异硫氰酸荧光素,四乙基罗丹明,四甲基异硫氰酸罗丹明,酶作用后产生荧光的物质。目前荧光素广发应用在免疫荧光、免疫荧光染色实验中。

下面介绍几种常用荧光素及其基本生物学特性:

1、异硫氰酸荧光素,简称“FITC”。是一种小分子荧光素,其效率取决于于溶液的pH值,因此,在使用FITC时应注意溶液的酸碱度。FITC分子量为389.4,吸收光波长为490~495nm,发射光波长为520~530nm,呈现明亮的黄绿色荧光。

FITC在冷暗干燥处可保存多年,是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感,通常切片标本中的绿色荧光少于红色。

2、藻红蛋白,简称“PE”。相对分子质量较大,约为240kD,吸收峰为564nm,当使用488nm激光激发时其发射荧光峰值约为576nm,故可能会对其它大探针产生空间位阻。

但PE的化学结构非常稳定,有很高的荧光效率,并易与抗体分子结合。需要注意的是PE作为天然染料,因来源不同可能造成荧光素结构上的微小差别,导致其特征的不一致。

3、PI和EB。两者都具有嵌入到双链DNA和RNA的碱基对中并与碱基对结合的特异性。为了获得特异的DNA分布,染色前必须用RNA酶处理细胞,排除双链RNA的干扰。

PI和EB不能进入完整的细胞膜,因此,又可以用于检测死活细胞。PI和EB各种理化性质相似,但PI比EB的发射光光谱峰向长波方向移动,因而在做DNA和蛋白质双参数测量时,PI的红色荧光和FITC的绿色荧光更易于区分和测量。另外,PI比EB测得的DNA分布的变异系统(CV值)低,所以PI得到更广泛的应用。

4、其它荧光素

单激光束三色荧光分析时,要求单激光激发,所选择的三种荧光素的发射光波长应该有所不同。除FITC(发射绿光)、PE(发射橙光)外,还应选择发射红光或深红光的藻红蛋白-花青素(phycoerythrin and cyanidinPC5)、叶绿素蛋白(peridinin chorophyll protein,PerCP)或藻红蛋白-德克萨斯红(phycoerythrin and Texas Red tandem,ECD)。因为这些荧光素在受到488nm的蓝光激发后,均发射出红色光或深红色的发射光。

(1)PC5和ECD是由在空间结构上互补的两个荧光素分子通过共价键结合而成,组成一个荧光分子。PC5由PE和cyanidin 5组成,ECD由PE和Texas Red组成。他们前一个分子的发射光波谱与后一个分子的激发光波谱相重合,这样,当前一个分子受激光激发后,产生的发射光可直接激发后一个分子,最后由后一个分子的发射光体现出整个组合的荧光特性。因此,此组成上说是两个分子,但表现为一个分子的物理性质。

(2)PerCP是从一种生活于深海区域的鞭毛虫中发现的色素,其功能为将可渗透入深海的落光传递至鞭毛虫的叶绿素发色基团,进而发出红光。需注意的是PerCP为单个分子。

(3)别藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC)和花青素5(cyanidin 5,Cy5)这两种荧光素的激发光波长要求在630nm左右,需第二根激光来激发。

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