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辣根过氧化物酶的制备原理、步骤和活性测定介绍

发布日期:2021/1/22 9:28:52

辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP),是临床检验试剂中的常用酶。该产品不但广泛用于多个生化检测项目,也广泛运用于免疫类(ELISA)试剂盒。过氧化物酶作为多个试剂盒显色体系的关键成分,对试剂盒的质量有重要影响。

该酶催化

Donor+ H2O2--→Oxidized donor+2 H2O。

辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)  比活性高,稳定,分子量小,纯酶容易制备,所以最常用。HRP广泛分布于植物界,辣根中含量高,它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白,糖含量18%。HRP由多个同工酶组成,分子量为40,000,等电点为pH3~9,酶催化的最适pH因供氢体不同而稍有差异,但多在pH5左右。酶溶于水和58%以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白吸收光谱分别为403nm和275nm,一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小,非酶蛋白就越多。

用途

(1) RZ>3 活性 >250u/mg, 主要应用于免疫学,是高纯度的过氧化酶。采用特殊色谱纯化技术以除去会影响免疫学反应的同工酶B .

(2) RZ>2 活性 >180u/mg ,主要应用于临床化学,我们的客户也有将这个规格的产品应用于免疫学研究的。此时,一个标准化的分析方法就变得尤为重要。

(3) RZ>1 活性 >100u/mg,主要应用于血糖试纸和尿液分析试纸。

(4) RZ>0.6 活性 >60u/mg ,主要应用于尿液分析试纸。

制备

实验原理:过氧化物酶催化以下反应:

2 H2O2 →O2+2H2O

这一类酶以铁卟啉为辅基,所以属血红素蛋白质类(hemeProteins)。过氧化物酶在生物界分布极广,在细胞代谢的氧化还原过程中起重要的作用。

本实验是以辣根为原料,经过水的抽提,硫酸铵和丙酮分级分离,再经锌离子纯化,透析除盐,冷冻干燥,最后制得高纯度的辣根过氧化物酶。

辣根过氧化物酶分子量在40,000左右,是一种含亚铁血红素的蛋白质,等电点7.2;易溶于水,溶解度为5%(W/V),溶液呈棕红色,透明;也溶于0.58饱和度以下的硫酸铵溶液,而0.62饱和度以上则不溶。该酶最适pH为7.0(对愈创木酚为氢给体而言)。在室温下HRP在几周内保持稳定,加热到63℃后15分钟内稳定。

辣根过氧化物酶氧化还原电势很低,pH6.08时,E’0= -0.2070V;pH为7.71时,E’0= -0.5787V。

辣根过氧化物酶的作用机理可分以下几步:

步,形成绿色有活性的酶一底物复合物Ⅰ:

第二步,复合物Ⅰ转变成红色有活性的复合物Ⅱ:

复合物Ⅰ+AH→复合物Ⅱ+A

第三步,复合物Ⅱ被还原,释放出酶:AH:表示还原型氢供体。

在一定程度上复合物Ⅱ可自发地分解成HRP和产物(P),亦可与过量的过氧化氢形成无活性的复合物Ⅲ。

复合物Ⅱ自发地分解

辣根过氧化物酶的活力测定方法有多种,主要原理介绍如下:

1、Rz值,提纯工作的后几步以及纯酶溶液可用Rz值表明酶的纯度。

403nm处的吸收代表血红素辅基的吸收,275nm的吸收是蛋白质的吸收,结晶的HRP的Rz值为3.04。测定时的酶浓度为1毫克蛋白/毫升。

2、愈创木酚法:测k4[见反应式⑶]。以愈创木酚(邻甲氧基酚,guaiacol)为氢给体

四邻甲氧基连酚有色产物四邻甲氧基连酚(E470nm = 26.6mM-1·cm-1)生成的速度(dx/dt)与底物过氧化氢以及氢供体愈创木酚的浓度有关。方程如下:

e—酶浓度;

α0—氢供体起始浓度;

x0为过氧化氢的起始浓度。

如果测定的条件选择成k4α0>>k1x0,可以测得k1:

上述测定Rz值和k4值的方法虽然比较简单,但都不能测得酶的实际活力单位。测定过氧化物酶的传统方法是连苯三酚试验法,以过氧化氢为底物,在酶作用下,连苯三酚可形成红棓酚(Purpurogallin),在430nm处测定产物的形成。用红棓酚值(PZ)表示酶的活力。PZ表示在标准测定条件下1毫克酶所形成的红棓酚微克数。

仪器和试剂

仪器:离心机、干燥器、分光光度计。

试剂:

1 硫酸铵:工业纯和化学纯;

2 丙酮。

3 10mM pH7.0磷酸盐缓冲液:称取243.5毫克磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)和857毫克磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O),溶于400毫升水中。

⒋ 20mM愈创木酚溶液:取0.22毫升愈创木酚加水至100毫升。

⒌ 40mM过氧化氢溶液:取0.4毫升30%过氧化氢加水至100毫升(如测k1则用10mM过氧化氢溶液)。临用前配制。

⒍ 5%乙酸钡溶液

7 奈氏试剂

⒏ 0.1 mol/L硝酸银溶液

操作步骤

(一)HRP的制备

⒈水提取:

称取 10斤用水冲刷干净的鲜辣根(辣根皮中亦含有丰富的HRP),用菜刀切成小碎块,在搅肉机中搅碎1~2次。碎渣浆用1倍体积的水在低温下搅拌提取过夜(亦可采用高速抽提法)。次日用甩干机(或离心机)甩干,收集滤液,碎渣再用1/4倍体积水浸泡提取一次,合并两次滤液,量总体积和度,0。

⒉硫酸铵分级分离:

在不断搅拌下,每升滤液中慢慢加入226克硫酸铵粉末(相当于0.40饱和度),大约在1~2小时内加完,置冷室中放置过夜。次日将上清液小心地用虹吸管移出,下面浑浊液以3000转/分离心15分钟,弃沉淀,合并上清液。再按每升上清液加258克硫酸铵粉末(0.8饱和度)随加随搅拌,当硫酸铵全部溶解后,置冷室过夜。次日,虹吸出上清液,沉淀部分在冰冻离心机中以13000转/分离心20分钟,弃去上清液,收集沉淀。将沉淀悬浮于100~150毫升蒸馏水中(加水量要使沉淀全部溶解为止),分装于透析袋内,放在流动自来水中进行透析1~2天,直到硫酸铵透析完毕为止(可用5%乙酸钡溶液或奈氏试剂进行检查)。然后改换成用蒸馏水透析,中间更换2~3次,用0.1 mol/L硝酸银溶液检查透析外液无氯离子为止。

将透析液合并,在冰冻离心机中以 4000转/分离心 15分钟;去沉淀,量上清液的体积。

⒊丙酮分级分离:

将上清液倒入烧杯并置冰盐浴中,在不断搅拌下,用细滴管沿杯壁加入1倍体积预冷至-15℃的丙酮,放置片刻,在冰冻离心机中以4,000/分离心15分钟,弃去沉淀。上清液再加入0.8体积(按原上清液体积)-15℃丙酮,(操作同上),静置后,在冰冻离心机中离心收集沉淀。将沉淀溶于少量蒸馏水中,透析除丙酮。可得Rz值近于1的酶溶液。

⒋精制:

将上步酶液适当稀释,滴加1M硫酸锌溶液,使酶液中锌离子浓度为10-3M,5000转/分离心10分钟,得上清液。再将沉淀用少量蒸馏水洗涤,离心,洗液与清液合并,分装于透析袋内,对水透析除盐,用微孔滤膜过滤,进行真空冷冻干燥(约得20毫克),产品呈米黄色纤维状松软物,HRP产品的Rz值可达3.0左右,置真空干燥器中低温保存。

HRP的活力测定

⒈活力测定:测定k4值的方法操作如下:

取2个比色池(带盖,光程1厘米),按下表加入反应物

*酶液:将1毫克蛋白/毫升的酶液用磷酸盐缓冲液稀释10倍后应用。

加好反应物,摇匀,在470nm 读出OD值,为t=0 的读数。立即加0.01毫升40mM过氧化氢溶液于2个比色池中,即刻摇匀并记时,每隔30秒钟读数一次,约5分钟。并记下实验时的室温。

将所测样品的OD值减去相应时间对照的OD值,然后以OD值为纵坐标,时间为横坐标作图。得一直线,计算出平均每分钟光密度的增加值,即求出△x/△t,按公式⑻求出k4值。实际的实验值k4 = 2.2×10,k4 = 3.1×10,而k4 应当为3.3×10。该方法用于测定粗的无细胞提取液误差较大。

因为某些物质可干扰四邻甲氧基连酚的形成。

或不求k4值,而把在上述条件下,每分钟OD470增加0.001所需酶量定为1个HRP活力单位。

⒉蛋白质含量的测定:

将酶液适当稀释后,用 Folin一酚试剂法比色测定蛋白质含量。

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