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Y79细胞的应用

发布日期:2021/4/14 8:41:22

背景[1-3]

Y79细胞是从病人右眼切除的肿瘤进行原代培养建立而成,此病人有很强的视网膜母细胞瘤的母系家族遗传性。该细胞的超微结构,如核膜内折、三层膜结构、大的被膜小泡、环孔板、微管、中心粒、基粒等都与原始肿瘤相似。

Y79细胞

培养操作

1)复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入10cm皿中,加入约8ml培养基,培养过夜)。第二天换液并检查细胞密度。

2)细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。

1.弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1:2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

应用[4][5]

用于顺铂诱导视网膜母细胞瘤Y79细胞自噬的作用和机制研究

探讨顺铂诱导的视网膜母细胞瘤Y79细胞自噬的作用及机制。

方法Y79细胞按浓度为0、1、5、10、20μM加入Cis培养,CCK-8法检测细胞IC50。将Y79细胞分为对照组(Control)、顺铂组(Cis)和顺铂联合应用自噬阻断剂3-甲基腺嘌呤组(Cis+3-MA),透射电镜观察自噬体;单丹磺酰尸胺(Dansylcadaverine,MDC)对细胞进行染色,流式细胞仪检测各组光密度(OD)值;

各组细胞按0、5、10、25、50、100μM加入Cis培养,CCK-8法检测细胞抑制率;Annexin V/PI双染流式法检测各组细胞凋亡;q-PCR检测各组细胞[凋亡及存活相关(Bax,Bcl-2)以及耐药相关(MRP3、MRP7、P-gp)]基因的转录情况。Fluo-4 AM钙离子荧光探针检测Y79细胞加入顺铂前后细胞内钙离子水平变化;Western Blot检测CaMKK2、AMPK、mTORC1、LC3蛋白表达情况。

结果顺铂处理细胞后,透射电镜观察到双层或多层膜的球状结构的自噬小体明显增多,应用自噬阻断剂3-MA后,自噬小体数量减少;MDC染色流式细胞仪测定OD355,Cis组OD值至明显高于Control组(P<0.01),Cis+3-MA组OD值低于Cis组(P<0.05);

应用自噬阻断剂3-MA预处理细胞后,各浓度点顺铂抑制率均大于单独应用顺铂处理的细胞;顺铂处理细胞后,与Control组相比凋亡率增加(P<0.05)应用3-MA下调自噬水平后,凋亡率进一步增加(P<0.05);

与Control组相比,Cis组抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调(P<0.01),Bax表达上调(P<0.01),各组细胞耐药相关基因MRP3、MRP7和P-glycoprotein转录水平降低(P<0.01);

加入自噬阻断剂3-MA后Bcl-2表达进一步下降(P<0.01),Bax较Cis组上升(P<0.05),耐药相关基因MRP3、MRP7和P-glycoprotein转录水平进一步降低(P<0.05)。

Fluo-4 AM钙离子探针染色激光共聚焦显微镜观察结果显示,顺铂处理肿瘤细胞后,细胞内荧光水平明显高于对照组;Western-blot结果显示,与Control组比较,Cis组钙调素依赖的蛋白激酶激酶2(CAMKK2)、p-AMPK、LC3II明显上调,mTORC1下调(P<0.05)。

参考文献

[1]AJCC Cancer staging handbook:from the AJCC Cancer stagingmanual(7th edition).Vincenzo C,Luigi M.European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging.2011

[2]Intravitreal injection of melphalan for intraocular retinoblastoma.Suzuki S,Aihara Y,Fujiwara M,et al.Japanese Journal of Ophthalmology.2015

[3]Selective autophagy in cancer development and therapy.Dikic Ivan,Johansen Terje,Kirkin Vladimir.Cancer Research.2010

[4]Superselective intraophthalmic artery chemotherapy in a nonhuman primate model:histopathologic findings.Tse BC,Steinle JJ,Johnson D,et al.JAMA Ophthalmol.2013

[5]刘颖.顺铂诱导视网膜母细胞瘤Y79细胞自噬的作用和机制[D].华北理工大学,2018.

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