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HACAT人永生化角质形成细胞的应用

发布日期:2021/5/14 9:28:04

背景[1-3]

HACAT人永生化角质形成细胞源自一位62岁患有黑色素瘤男性的病灶外围正常皮肤,角蛋白、角化细胞交联外膜蛋白、中间丝相关蛋白阳性。

角质形成细胞是表皮的主要构成细胞,数量占表皮细胞的80%以上,在分化过程中产生角蛋白。根据分化阶段和特点可分为五层,由内至外分别为基底层、棘层、颗粒层、透明层和角质层。

角质形成细胞的特点是可以产生角蛋白。角质形成细胞自最下面的基底细胞不断增殖,在向上移动的同时产生坚韧的角蛋白。角质形成细胞间通过一种称为桥粒的结构紧密连接在一起,当桥粒连接出现问题时会导致各种皮肤水疱性疾病的发生。

HACAT人永生化角质形成细胞

最外层的角质层一般由5~20层已经死亡的扁平细胞组成。这些细胞没有细胞核或其他的细胞结构,细胞中充满了角蛋白和无定形基质组成的复合物。角质层细胞的排列非常有特点,呈叠瓦状,其边缘与邻近的角质层细胞互相交错重叠,使角质层可以起到很好的屏障作用。

角质层细胞周围包绕着丰富的脂质,因此角质层不但坚韧,而且也是人体的一层天衣无缝的保护屏障。

应用[4][5]

用于氧化应激在亚砷酸钠诱导人永生化角质形成细胞(HaCaT)适应性反应中的意义研究

探讨低剂量亚砷酸钠染毒诱导人永生化角质形成细胞(Human HaCaTKeratinocytes,HaCaT)适应性反应中氧化应激和Keap1/Nrf2-ARE信号通路的表达及其意义。

方法1.染毒剂量确定:以HaCaT细胞为研究对象,用0.1、0.15、0.6、2.5、5.0、10.0、20.0和40.0μM亚砷酸钠(NaAsO2)进行细胞染毒,采用MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测细胞增殖率。通过增殖曲线和GraphPad Prism6软件计算亚砷酸钠染毒半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50),从而确定后续诱导适应性反应实验的预处理剂量和冲击剂量。

2.实验分组:将用于实验的HaCaT细胞分为预处理组和无预处理组。预处理组HaCaT细胞在加入含0.15μM亚砷酸钠的细胞培养液培养24h后,换用含10μM亚砷酸钠的细胞培养液继续培养0、4、8、12、24和36h;无预处理组待HaCaT细胞处于生长对数期时,直接换用含10μM亚砷酸钠的细胞培养液继续培养0、4、8、12、24和36h。

3.氧化应激指标检测:实验染毒终点收集细胞,采用流式细胞仪检测HaCaT细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,采用ELISA方法检测HaCaT细胞内丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的变化。

4.Keap1/Nrf2-ARE抗氧化通路相关蛋白检测:实验染毒终点收集细胞,通过Western blot方法检测Keap1/Nrf2-ARE信号通路发挥抗氧化作用的关键蛋白核转录因子红细胞系-2p45(NF-E2)相关因子-2(nuclear factor erythroid-2p45-relatedfactor2,Nrf2)、Nrf2的胞浆抑制蛋白Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-likeECH-associated protein1,Keap1)和Nrf2的胞核竞争蛋白BTB-CNC异体同源体1(BTB and CNC homology1,BACH1)在HaCaT细胞胞浆和胞核中的表达情况,以及HaCaT细胞中抗氧化相关酶类的表达情况,包括血红素单加氧酶(hemeoxygenase1,HO-1)蛋白水平和细胞总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力改变情况。

参考文献

[1]The NRF2-KEAP1Pathway Is an Early Responsive Gene Network in Arsenic ExposedLymphoblastoid Cells.Cordova E.J,Martinez-Hernandez A,Uribe-Figueroa L.et al.PLoS One.2014

[2]Expression of heme oxygenase-1 in human leukemic cells and its regulation by transcriptional repressor Bach1.Takuya Miyazaki,Yohei Kirino,Mitsuhiro Takeno,Sei Samukawa,Maasa Hama,Masatsugu Tanaka,Satoshi Yamaji,Atsuhisa Ueda,Naoto Tomita,Hiroyuki Fujita,Yoshiaki Ishigatsubo.Cancer Science.2010

[3]Comparison of arsenic-induced cell transformation,cytotoxicity,mutation and cytogenetic effects in Syrian hamster embryo cells in culture.Lee TC,Oshimura M,Barrett JC,et al.Carcinogenesis.1985

[4]Phosphorylation of Nrf2 at multiple sites by MAP kinases has a limited contribution in modulating the Nrf2-dependent antioxidant response.Sun Zheng,Huang Zheping,Zhang Donna D.PloS one.2009

[5]许熙国.氧化应激在亚砷酸钠诱导人永生化角质形成细胞(HaCaT)适应性反应中的意义[D].苏州大学,2014.

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