柱层析硅胶的应用

背景及概述^[1]

柱层析硅胶分为正相柱层析硅胶和反向柱层析硅胶2 种，正相柱层析硅胶填料为正相硅胶，适合分离相对极性较小的化合物，例如各类苷元；所以通常选用极性较小的有机溶剂作为洗脱剂，例如石油醚-二氯甲烷洗脱系统，氯仿-乙酸乙酯洗脱系统等。反向柱层析硅胶使用的是反相硅胶，适合分离极性相对较大的化合物，例如生物碱等各类苷类，常采用甲醇-水，乙腈-水不同比例作为洗脱剂。

柱层析硅胶在上样时，常分为干法上样和湿法上样。干法上样将待分离物质溶解后拌在少量硅胶 G中，待挥发至干后填入装好的硅胶柱中，再加层析液进行洗脱。湿法上样先将硅胶 G 用洗脱液溶胀后装入硅胶柱，再将溶解好的样品倒入硅胶柱进行分离。这2 种方法对物质分离效果差别不大，湿法上样操作简单便捷，但溶解样品用二氯甲烷、乙酸乙酯等极性较小的溶剂，对于一些溶解度小的物质，宜使用干法上样。

应用举例^[1]

从天然产物中提取、分离和表征生物小分子，是新药研发中获得先导化合物的主要途径之一。层析法（Chromatography）是天然产物分离最常用的方法之一。 层析法最早是根据化合物颜色分离一些植物色素，如今，层析法已经演变成为一种高度敏感的、有效的化合物分离和鉴定方法。柱层析一般包括常压柱层析、中压柱层析和高压柱层析。按照柱填料又可分为柱层析硅胶、离子交换层析、凝胶渗透色谱、疏水作用色谱等，其中以柱层析硅胶（正/反相）使用最为广泛。与其他层析方法相比，柱层析具有操作简单，经济实惠 ，样品承载量大等优点，是天然产物分离纯化的首选方法之一。

1拌样

 拌样是柱层析硅胶干法上样的一个重要环节。拌样所用的硅胶 G 的量要合适 ，一般以样品质量∶硅胶G质量=1∶3 为宜。若硅胶G 过多，则柱层析样品层过厚，各个组分容易发生交错重叠；若硅胶G过少， 则样品不能完全吸附 在硅胶G中，使样品损失严重。此外，拌样不均匀也是影响实验结果的重要因素。具体方法如下：

1）称取1g粗提物，按照粗提物质量∶硅胶G质量=1∶3 称取3g硅胶G于蒸发皿中。

2）将样品用有机试剂完全溶解，在通风厨中吸取少量样品滴加到硅胶G中，用药勺将样品搅拌均匀，待样品挥发至干后继续滴加样品，直至将样品全部拌入硅胶G中。期间不断用药勺搅拌硅胶G防止拌样不均匀。

3）将挥发干的硅胶G在通风厨中放置过夜，使有机试剂完全挥发。

2装柱

装柱是柱层析硅胶最重要的环节 ，柱子质量直接决定样品的分离效果和得率。首先，保证柱身竖直，否则洗脱时样品条带会呈倾斜，严重时洗脱产物不纯，需要重新纯化。其次，硅胶G要压实，不能留有气泡，否则样品条带会呈弥散型 ，影响分离效果。具体步骤如下：

1）将玻璃柱竖直架于铁架台上。

2）按照质量比样品∶硅胶G=1∶40 称取硅胶G40g。将硅胶G倒入硅胶柱内，拍打柱身使硅胶粉压实，期间不断旋转柱体，使硅胶G填充均匀。

3）将拌好样的硅胶G倒入硅胶柱内，同样拍打柱身并不断旋转柱体，使样品层均匀。

4）在样品层上铺一层约0.5 cm厚的硅胶G，防止加层析液时样品层飞溅。

3 样品接收

配制 3 倍柱体积的层析液，超声10 min。打开玻璃柱阀门，缓慢将层析液倾倒入硅胶柱内至满。选择合适大小的试管接收流出液，一般10~20 mL/管为宜，流速1 mL/min，过快样品拖尾严重，过慢则样品条带弥散。如果目标产物与杂质极性相差不大，可以采用梯度层析系统。梯度层析又称梯度洗脱，是指用不同极性洗脱剂分别对样品进行洗脱，达到分离的效果。正相柱层析硅胶如需要梯度层析，则按照层析液极性由小到大依次倒入物质硅胶柱内。注意层析液极性差别不应过大，且换层析液极性前，尽可能将硅胶上方的层析液流尽。

4 检测与合并

以 20 mL/管收集流出液，共收集10管，分别对这 10 管 流 出 液 进 行 TLC 检测，展开剂为二氯甲烷∶乙酸乙酯=9∶1（图3）。合并1~4 管，5~7管 ，8~10管，旋蒸至干计算样品质量，分别为7 mg，10mg和4 mg。分别转移至EP管中，编号样品 1、2、3，-20℃保存。合并时如果样品量足够，为了保证纯度，可以弃去纯度不高的接收液；如果样品量少，不足以进行之后的产物鉴定实验，要将所有含有目标物质的接收液合并，并进一步纯化。

主要参考资料

[1]刘延杰,陈弯弯,向碧云,朱旭东,郝晓冉.硅胶柱层析分离天然产物实验要点分析[J].生物学通报,2018,53(06):44-46.