生物样品中腺苷的检测方法及腺苷的药理作用

背景及概述^[1][2]

腺苷为一天然核苷酸，是机体代谢的中间产物，也是体内重要活性成分之一。腺苷做成的注射液1989年美国首次上市。腺苷(Adenosine, AD)即腺嘌呤核苷，是机体RNA的代谢产物，属于生物小分子化合物，它是一种内源性核苷，能参与血管神经舒张活动，具有抗心律失常的功效。在中枢神经系统中，它对神经传递的调节及对抵抗缺血性与疾病性神经伤害等方面具有重要作用。同时腺苷作为腺苷脱氨酶的作用底物，其含量变化也会间接反应腺苷脱氨酶的体内代谢水平，而腺苷脱氨酶活性的检测对于临床许多疾病的诊断都具有重要参考价值。

检测方法^[1]

有研究证实，腺苷作为肿瘤的潜在生物标志物具有重要意义，尿液中腺苷含量可以被用来检测疾病的病程。目前腺苷的检测方法，虽然可以达到检测要求，但是却存在许多的缺点，例如高效液相色谱法、紫外检测、流式检测法及气质/液质色谱法等都存在需要复杂的样本前处理、操作费时和仪器昂贵等缺点，因此建立一种简单、快速和高灵敏度的腺苷检测新方法有着重要的现实意义。本发明提供一种生物样品中腺苷含量的检测方法，基于核酸适配体识别技术和离子交换信号放大机制，具有高灵敏度、准确度和精确度。

为了实现上述发明目的，本发明CN201610211194.9以四氧化三铁纳米粒子（Fe3O4）为磁性分离器，碲化镉量子点（CdTe QDs）为荧光标记，核酸适配体为腺苷分子识别器件，银离子为离子交换反应置换离子。包括以下步骤：

步骤一、腺苷探针的制备：

（1）、表面修饰羧基的四氧化三铁磁性纳米粒子和氨基修饰的腺苷适配体1（ABA1）通过缩合反应结合；

（2）、巯基丙酸修饰的碲化镉量子点和氨基修饰的腺苷适配体2（ABA2）通过缩合反应结合；

（3）、将两种结合产物以等摩尔比溶于pH 7.4的PBS缓冲溶液中形成腺苷探针；四氧化三铁纳米粒子的粒径为8～12nm；碲化镉量子点激发波长为370nm，发射波长为550nm；表面修饰羧基的四氧化三铁磁性纳米粒子和氨基修饰的腺苷适配体1，其摩尔比为200: 1～250:1；巯基丙酸修饰的碲化镉量子点和氨基修饰的腺苷适配体2，其摩尔比为20:1～25:1。

步骤二、腺苷探针与腺苷结合并使之从生物样品中分离：

将腺苷加入步骤一制得的腺苷探针体系中，通过碱基配对形成腺苷三明治结构（Fe3O4-ABA1-AD-ABA2-CdTe QDs），通过磁性分离将其从生物样品中分离；孵育时间为30min，孵育温度为20～40℃。

步骤三、运用银离子与三明治结构中的镉离子的离子交换作用定量腺苷含量：在步骤二分离得到的腺苷三明治结构中加入定量且相对过量的银离子溶液，银离子与腺苷三明治结构中的碲化镉量子点进行离子交换反应，取代二价镉离子生成碲化银沉淀并破坏原有量子点结构，消耗了部分银离子，其消耗含量与腺苷含量成正比。经过离心弃去沉淀，利用碲化镉量子点作为荧光探针，检测出反应上清液中剩余的银离子浓度。通过计算在加入腺苷和未加入腺苷的情况下银离子检测体系的荧光的比值对腺苷进行定性和定量。离子交换反应时间为20min，离子交换的反应体系为pH 7.4的PBS缓冲溶液。

本发明以腺苷适配体分别标记碲化镉量子点与四氧化三铁磁性纳米粒子组成生物荧光探针，结合离子交换荧光信号放大技术，建立了一种简便、快速地检测癌症指标物腺苷的新方法，腺苷检测原理图示如图1所示：图A中，腺苷适配体（5′-ACC TGG GGG AGT ATT GCG GAG GAA GGT-3′）被切分成两个不同的片段（ABA1和ABA2）。这两个核酸片段没有腺苷的存在下无法形成稳定的DNA二聚体结构。在加入腺苷后，这两段核酸片段能够结合腺苷，重新装配成稳定的三级结构。利用该特点，在偶联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）的作用下，将羧基修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子和巯基丙酸修饰的碲化镉量子点分别与均用氨基修饰的腺苷适配体片段ABA1和ABA2通过CO-NH化学键结合。由于腺苷适配体ABA1和ABA2只有在腺苷的存在下才能通过碱基配对互补结合在一起，因此，如图B所示，加入目标分子腺苷，腺苷与四氧化三铁纳米粒子连接的ABA1以及与碲化镉量子点连接的ABA2能够形成三明治结构（Fe3O4-ABA1-AD-ABA2-CdTe QDs）。

通过磁性分离，将该三明治结构从生物样品中分离。由于碲化镉量子点纳米晶体中包含成千上万的二价镉离子，加入银离子溶液作为离子交换试剂，生成的碲化银相比于碲化镉更具有热力学稳定性，因此在常温下银离子就能够迅速地将三明治结构中的镉离子置换出来，将量子点的结构完全破坏。因此在腺苷三明治体系中加入过量的银离子溶液，银离子与腺苷三明治结构中的碲化镉量子点进行离子交换反应，消耗了部分银离子，其消耗含量与腺苷含量成正比。经过离心弃去沉淀，利用碲化镉量子点作为荧光探针，检测出反应上清液中剩余的银离子浓度。

由于银离子对碲化镉量子点有很强的荧光猝灭作用，因此荧光检测探针碲化镉量子点的荧光猝灭值越小，说明剩余的银离子含量越少，则与三明治结构中的碲化镉量子点发生离子交换反应的银离子含量越多，则三明治结构中腺苷的浓度越高。因此腺苷的浓度与作为荧光探针的碲化镉量子点的荧光淬灭值成反比。通过计算在加入腺苷和未加入腺苷的情况下银离子检测体系的荧光的比值对腺苷进行定量。本发明可高灵敏检测分析目标，能够检测到0.210nM的腺苷，线性范围在0.330nM～167nM，线性范围广。

药理作用^[2]

 腺苷为一天然核苷酸，是机体代谢的中间产物，也是体内重要活性成分之一。其作用系通过激活腺苷受体(A受体)而实现。在心房、窦房结及房室结，腺苷通过与A受体结 合而激活G蛋白偶联的钾通道，使 K⁺外流增加，细胞膜超极化而降低自律性。它还能明显增加cGMP水平，延长房室结的ERP和减慢传导，抑制交感神经或异丙肾上腺素所致早后、迟后除极而发挥抗心律失常作用。本品暂未被分类于Ⅰ～Ⅳ类抗心律失常药中。

药代动力学^[2]

本品代谢迅速，T_1/2仅10～20s，起效快而作用短暂。故必须快速iv。但国外也有专供iv drip制剂。

临床应用和适应症^[2]

 本品特点是抑制房室结的传导，可立即终止由房室结折返引起的阵发性室上性心动过速，几乎100%有效，对W-P-W型预激综合征也有同样效果。对房扑、房内折返所致的心律失常无效。

主要参考资料

[1] CN201610211194.9 一种生物样品中腺苷含量的检测方法

[2] 最新药物手册