蟛蜞菊内酯的制备及药理研究

发布日期:2020/10/26 11:48:35

背景及概述^[1][2]

蟛蜞菊内酯(wedelolactone)，化学名：7-甲氧基-5，11，12-三羟基苯骈呋喃香豆素，化学结构式如下，蟛蜞菊内酯为香豆素类化合物，具有保肝、抗炎、增强免疫等功效，1956年由Govindachari等人首次从蟛蜞菊(WedeliaCalendulacea)植物中分离得到，具有抗炎、止血、治疗肺炎、肝硬化等功能，还可作为蛇毒的有效解毒剂，哈佛大学医学院的袁钧瑛教授发现蟛蜞菊内酯能够抑制脂多糖介入半胱天冬酶-11(Caspase-11)的诱导作用，可以用来治疗腐败性休克、中风和其它炎症方面的疾病。

制备^{[1] [3]}

一、目前，从墨旱莲中制备蟛蜞菊内酯的报道多为实验室规模，步骤较繁琐，如张金生等（药学学报，36(1):34-37，2011）报道采用石油醚-乙醚-甲醇或95%甲醇渗滤提取、甲醇溶解除杂或乙酸乙酯萃取除杂、硅胶柱分离获取蟛蜞菊内酯，其中分离洗脱剂采用甲苯-丙酮-醋酸（6:8:1）或二氯甲烷-甲醇-水（14:9:4下层）。

CN201310082363.X提供一种工艺简单、易规模化的制备新方法，可以以墨旱莲醇提物为原料，经乙酸乙酯萃取、中压或减压硅胶柱色谱纯化、重结晶三个步骤，即可获得纯度大于98%的蟛蜞菊内酯化学对照品，其规模可达十克级。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案：

1）乙酸乙酯萃取：

墨旱莲醇提物，或墨旱莲药材经体积分数不小于70%的乙醇提取后减压干燥获得醇提物，加入提取物重量3-5倍体积的水，加热使其溶解，温度控制在30℃-40℃；加入提取物重量1-2倍体积的乙酸乙酯萃取，重复萃取2-4 次，合并萃取液，减压浓缩至醇提物重量的1/3～1/6体积（ml/g），然后拌入等比例重量（g/ml）的硅胶，干燥获得乙酸乙酯萃取物干粉；

2）中压或减压硅胶柱色谱纯化：

取径高比为2～12.5的不锈钢柱作为层析柱，装入萃取物干粉1-2倍重量的硅胶作为层析分离硅胶，干法上样；用石油醚：乙酸乙酯：醋酸（体积比8:2:1-6:4:1）混合溶剂洗脱，中压柱压力0.2-0.3MPa，减压柱压力在 -0.08-0.09MPa，薄层色谱检测，以石油醚：乙酸乙酯：醋酸（体积比 3:7:0.5-5:5:0.5）为展开剂，收集Rf值在0.40-0.48的洗脱液，减压浓缩，析出浅白色沉淀为蟛蜞菊内酯粗品；

3）重结晶：

上述对照品粗品用乙酸乙酯或甲醇溶解，-4℃-10℃以下放置析晶，即可获得纯度大于98%的蟛蜞菊内酯对照品，其外观为白色粉末。

二、全合成

蟛蜞菊内酯在化学结构上为一个多酚内酯，在碱性条件下容易分解，所以从天然产物中提取纯化比较困难，全合成制备方法已有报道。德国学者Wanzlick等1963年首次报道了由儿茶酚和4，5-二羟基-7-甲氧基香豆素为原料经催化环合制备蟛蜞菊内酯，但只提供了红外数据。印度学者Pandey等1989年报道了相似的合成方法，他们以蘑菇中提取的酚氧化酶酪氨酸酶(EC1.14.18.1)为催化剂在pH＝6.8条件下儿茶酚和4，5-二羟基-7-甲氧基香豆素反应环合得到蟛蜞菊内酯，该合成方法收率较高，但酶催化剂成本高，难实现工业化生产。经对现有技术的文献检索发现，中国发明专利(CN1566116)以3，4-二基苯甲醛和2，4，6-三羟基苯甲醛为起始原料，会聚式地合成两个关键中间体取代苯乙炔和碘取代苯，通过Sonogashira偶联反应，再经环合和脱保护等反应步骤得蟛蜞菊内酯，该合成方法中的关键中间体取代苯乙炔不易得，合成成本高，操作工艺繁琐(均为柱层析)，不适合工业化生产。

CN200810033010.X提供一种蟛蜞菊内酯的化学全合成方法，使其具有原料易得，工艺简单，成本低，适合工业化生产的特点，克服了现有合成方法的缺点。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明采用合成方便且易得的2-溴-4，5-二苄氧基苯胺为原料与取代苯乙炔进行Sonogashira偶联反应，经重氮化水解得化合物2-[(4-甲氧基-2，6-二苄氧基苯基)乙炔基]-4，5-二苄氧基苯酚，再经环合和脱保护等反应步骤得蟛蜞菊内酯。

本发明方法包括以下步骤：

步，2-乙炔-5-甲氧基-1，3-二苄氧基苯与2-溴-4，5-二苄氧基苯胺在钯催化剂作用下进行Sonogashira偶联反应得2-[(4-甲氧基-2，6-二苄氧基苯)乙炔基]-4，5-二苄氧基苯胺；

第二步，2-[(4-甲氧基-2，6-二苄氧基苯)乙炔基]-4，5-二苄氧基苯胺进行重氧化水解得化合物2-[(4-甲氧基-2，6-二苄氧基苯基)乙炔基]-4，5-二苄氧基苯酚；

第三步，2-[(4-甲氧基-2，6-二苄氧基苯基)乙炔基]-4，5-二苄氧基苯酚在催化剂钯作用下与一氧化碳进行羰基环合反应得化合物2-[(4-甲氧基-2，6-二苄氧基苯基)-5，6-二苄氧基]-3-苯并呋喃羧酸甲酯；

第四步，2-[(4-甲氧基-2，6-二苄氧基苯基)-5，6-二苄氧基]-3-苯并呋喃羧酸甲酯在Pd-C催化剂进行加氢反应得2-[(2，6-二羟基-4-甲氧基苯基)-5，6-二羟基]-3-苯并呋喃羧酸甲酯；

第五步，2-[(2，6-二羟基-4-甲氧基苯基)-5，6-二羟基]-3-苯并呋喃羧酸甲酯在酸催化下进行内酯化得蟛蜞菊内酯。

本发明采用化学全合成方法制备成蟛蜞菊内酯具有以下优点：本发明使用2-溴-4，5-二苄氧基苯胺代替不易得的碘取代苯进行Sonogashira偶联反应，经重氮化水解得中间体，其合成成本降低。羰基成环反应采用二氯化钯代替昂贵的二碘化钯，并且反应中所用的钯催化剂均进行回收再利用，大大降低成本；每步合成操作均采用重结晶的方法代替文献的柱层析，简化操作过程，可以实现工业化生产。

药理研究^[2]

自1956年首次从金盏蟛蜞菊中分离纯化得到蟛蜞菊内酯后，人们一直将其视为潜在药物单体进行研究，其抗癌功效也已渐渐被发现。研究表明，蟛蜞菊内酯能有效抑制前列腺癌、乳腺癌、垂体腺瘤等多种癌细胞活性，杀伤肿瘤细胞并诱导其凋亡。此外，30μmol/L蟛蜞菊内酯作用A549细胞36h后可显著提升p-Caspase3、p53、p-STAT1基因的转录翻译，而对STAT1的mRNA及蛋白表达无明显影响，这表示经蟛蜞菊内酯处理可活化A549细胞中p-Caspase3、p53、p-STAT1等基因表达，促使细胞凋亡。蟛蜞菊内酯呈一定剂量、时间依赖性降低A549细胞存活率，并阻滞细胞于G1期，增加细胞凋亡数量。蜞菊内酯可上调A549细胞p-Caspase3、p53、p-STAT1等基因转录翻译水平，而对STAT1基因表达无明显影响，说明其对非小细胞肺癌有一定积极的作用，其作用机制与阻滞周期和促凋亡作用相关。