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青霉素-链酶素溶液的应用

发布日期:2020/3/13 8:57:40

背景及概述[1][2]

青霉素-链霉素溶液,溶于0.85%NaCl溶液,含青霉素10000单位,链霉素10000μg/ml。

应用举例[2]

用于培养人表皮干细胞:

(1)将取下的人包皮组织用0.5%碘伏浸泡一分钟,PBS彻底漂洗两次至肉眼观察不再有碘伏着色。包皮组织来自第三军医大学西南医院泌尿外科12~20岁行包皮环切术无泌尿系 感染等疾病患者(患者知情同意);

(2)无菌条件下尽量修剪掉皮下脂肪组织,组织修剪为约0.5cm×1cm大小的皮片。

(3)加入0.25%的中性蛋白酶Ⅱ溶液充分覆盖组织块,4℃消化l2~16h;0.25%的中 性蛋白酶Ⅱ的配置及使用方法为,0.5gDispaseII(Roche)溶入100mL0.1MPBS,4℃、过夜, 再搅拌促溶解0.22um过滤,分装10ml/瓶,-20℃,保存;

(4)吸弃中性蛋白酶Ⅱ溶液,PBS清洗后用眼科镊轻轻牵扯组织,分离表皮与真皮;分 离表皮与真皮层时需特别注意保护表皮完整性,尽量避免真皮成分脱落(否则可致成纤维细胞污染);

(5)收集并剪碎表皮组织,加入0.25%胰蛋白酶溶液于37℃消化10min;

(6)加入含10%小牛血清RPMI164010mL终止消化后,吹打成混悬液,200目筛网研 磨过滤;

(7)1000rpm/min条件下离心5min以收集细胞;

(8)弃去上清液后,PBS洗涤一次;

(9)加入K-SFM并轻柔吹打制成2.5×105/mL单细胞悬液,接种4mL单细胞悬液于预 先包被了IV型胶原的25cm2培养瓶中,37℃静置10min;无血清角质细胞专用培养基 K-SFM配置方法为,K-SFM(Invitrogen10725):加入rEGF:(0.1~0.2)ng/mL,BPE:(20~30) μg/mL;加入CaCl20.05mM;双抗(青酶素-链酶素溶液)100U/mL;IV型胶原包被培养瓶或培养板的方法为,按照10μg/cm2计算,将适量0.lmg/mL的IV型胶原溶液加入细胞培养 瓶或培养板中,保证液面能够充分覆盖培养瓶或培养板底部即可;放置4℃冰箱,过夜(约 12小时)或更长时间。使用前应用PBS液清洗IV型胶原包被了的培养瓶或培养板;

(10)吸去上层细胞悬液,用PBS轻轻漂洗两次,加入适量4mLK-SFM;

(11)37℃、5%CO2孵箱培养(常规培养);

(12)次日更换细胞培养液,继续常规培养,每2天换液1次。

(13)待细胞生长密度为70~80%时,进行细胞传代,包括如下步骤:

a、吸弃原细胞培养基,PBS洗2次;

b、加入0.25%胰酶1~1.5mL,37℃、5%CO2孵箱孵育6~10分钟(镜下观察大部分细胞脱落时终止消化);

c、加入含10%小牛血清RPMI164010mL终止消化后,吹打成单细胞混悬液;

d、移入离心管中,1000rpm/min条件下离心5min以收集细胞;

e、按1︰5传,加入K-SFM培养液;常规培养,共传代8次。

本发明方法具有快速、高效、方法简便、细胞活性高、细胞干性 强等特点。采用本发明方法培养人表皮干细胞至少能传到8代,极大提高了细胞扩增倍数; 且分化控制好、细胞成分单一,因而具备了应用到临床上的基本条件。

主要参考资料

[1] 青霉素-链霉素溶液(100×)说明书

[2] CN201410112277.3 人表皮干细胞的分离与培养方法

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2020-03-13
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