猴头菇多糖的制备方法

背景及概述^[1]

猴头菇又名猴头、猴头蘑、猴头菌、刺猬菌等，是一种大型真菌，属担子菌纲、多孔菌目、齿菌科、猴头属，因其子实体形状像猴子头部而得名。据报道，猴头菌所含有的营养成分与目前人工栽培的其他食用菌相比都居、二位。包括丰富的蛋白质、脂肪、纤维素、多糖，还含有16种氨基酸，其中有八种人体必需氨基酸，而且各种氨基酸的比例与人体需要接近，猴头菇味道鲜美，与熊掌、海参、鱼翅齐名，为我国传统的“四大名菜”。猴头菇多糖是研究最多的成分之一。大量的医学和药理学研究表明，猴头菇多糖具有提高免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血脂等生理功能。猴头多糖制成的药物和保健品深受人们喜爱，开发前景广阔。

制备^[1-2]

1)猴头菇粗多糖提取

目前常用的猴头菇多糖的提取方法有碱提法、酸提法、盐提法还有热水浸提法。稀酸、稀碱法，试剂用量少，仪器均为常规仪器，因此操作简单易行。但稀酸、稀碱条件下，易使多糖发生糖苷键的断裂，部分多糖发生水解而使多糖的提取率减少，而且杂质含量也比较多，有一定的适用范围。目前最常用的是水提醇沉法。此法操作简单，杂质含量相对较少。多数研究表明猴头菇子实体热水浸提的工艺为：温度80℃，料液比1:20，乙醇浓度90%～95%，浸提时间4h，浸提次数3次。研究表明，提取率会随提取部位、提取条件的不同而不同。杨焱等实验结果表明，每1kg菌丝体中含多糖13.63g，而每1kg猴头菇子实体中含多糖44.36g，是菌丝体的3倍。此外，菌种、生长条件等都会影响多糖含量，多糖含量受多种因素影响。

2）猴头菇粗多糖纯化

纯化主要包括脱蛋白、脱色和分级沉淀等步骤。据资料显示，粗多糖脱蛋白纯化以后，其生物活性更高。因此，为提高其活性，同时为进一步研究多糖提供较纯的物质原料，必须要对粗多糖进行脱蛋白处理。另外，颜色较深的粗多糖必须脱色，否则测量时误差会增大。脱蛋白可采用Sevag、三氯乙酸(TCA)法和酶解法。目前最常用的是Sevag法，但有研究证明三氯乙酸法比Sevag效果好，且多糖损失少。酶法应用比较少，因为酶法选择性高，不容易找到合适的酶。但用合适的酶脱蛋白效率高、蛋白脱除彻底，应用前景广阔。脱色可采用活性炭、H2O2或DEAE-纤维素法。低聚糖小分子物质采用透析法除去。多糖分级可采用乙醇分级沉淀法、电泳法、超滤法和柱层析法。常用的柱层析法有DEAE-纤维素柱，Sephadx柱、Sepharose柱等。纯度鉴定主要有聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、高效液相色谱法(HPLC)、薄板层析法(TLC)和凝胶过滤色谱(GPC)法。

结构研究进展^[1]

1）结构分析方法

多糖分子量测定可采用HPLC、TLC、GPC、SepharoseCL-6B凝胶柱层析、质谱法(MS)等；单糖及其结构的分析主要采用酸水解法、HPLC、TLC、气象色谱(GR)、核磁共振(NMR)、MS等方法；连接次序选择酸水解、糖苷酶顺式水解、NMR法；α-、β-异头碳采用糖苷酶顺式水解、NMR法、红外光谱法(IR)等方法；羟基取代情况采用甲基化反应-气相色谱、过碘酸氧化、NMR、IR、MS等方法。糖链-肽链联结方式采用酸水解、肼解反应等。

2）结构研究进展

猴头菇的有效药理成分尚未完全研究清楚，到目前为止已从猴头菌中分离得到许多化合物。但已知有确切疗效的是猴头菇多糖和齐墩果酸，其中猴头菇多糖(Hericiumerinaceuspolysaccharides-HEP)是最主要的活性物质。吴克等在1998年的分析结果表明猴头多糖红外光谱有三个吸收峰，表明有三种成分。从猴头菇子实体中提取、分离纯化得到5种多糖HEP1～HEP5，其中HEP1和HEP4为杂多糖，HEP2为酸性多糖，HEP3和HEP5为葡聚糖，IR的特征吸收显示前者主要为β-葡聚糖，而后者则为α-葡聚糖。5种多糖主要含以D-葡萄糖为主的中性糖，以葡聚糖含量最多，其中HEP1、HEP2为新类型的真菌多糖。HEP1由鼠李糖、半乳糖和葡萄糖组成，摩尔比为1100:3120:0184；HEP2由葡萄糖组成，HEP3是由葡萄糖和葡萄糖醛酸组成的多糖，两者的摩尔比约为4:1。HEP4由鼠李糖、木糖和甘露糖组成，摩尔比为1100:2140:4160。分别用子实体和菌丝体为原料，分离得到子实体多糖纯品hfp-1、hfp-2和菌丝体多糖纯品hmp-1和hmp-2，其中hfp-2和hmp-1的量极微小。HPLC检测hfp-1和hmp-2为单一均匀多糖。猴头菌子实体多糖和菌丝体多糖在化学组成上有一定的差异。hfp-1的单糖组成为阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖，摩尔比为0.12:0.41:0.71。hmp-2的单糖组成为阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖，摩尔比0.250:0.41:0.41:0.31:1.0:0.29。

紫外光谱分析表明组成中不含核酸和蛋白质。红外光谱分析二者均有多糖特征吸收峰，hfp-1有β-型连接的吸收峰hmp-2无明显的β-型连接的吸收峰。hfp-1的分子量为54000，hmp-2的分子量为68000。分离出两种猴头菇多糖HPA和HPB。HPA由葡萄糖、半乳糖和岩藻糖组成，其比例为1:2.11:0.423。HPB含有半乳糖和葡萄糖，其比例为1:11.529。JIALianmeng、LIULiu等分离出一种新的主链由α-D-半乳糖组成的杂多糖，侧链为鼠李糖和葡萄糖，其比例为1.19:3.81:1.00[15]。分离一种猴头菇多糖，单糖组成为海藻糖和半乳糖，其比例为1:4.12。目前的研究结果一致认为多糖的活性部分为β-(1→3)糖苷键连接的主链和β-(1→6)糖苷键连接的支链构成的葡聚糖。它对小白鼠肉瘤180和艾氏腹水癌有明显的抑制作用。但JIALianmeng等分离出的多糖主链不含β-(1→3)糖苷键而是由α-D-半乳糖组成。它是新型结构的多糖，推测其活性部位很可能就是主链的α-D-半乳糖结构，但关于它对真菌多糖活性影响的研究还没有展开，还没有相关的证据。诸研究结果之所以会有这么大的差距，与猴头菌的种类、培养条件、提取部位及提取和分析方法有关系。真菌多糖的应用价值已受到人们的关注，但其各方面的研究缺乏系统性，对活性起决定作用的结构和机理的研究不够深入，另外在哪种提取和分析方法是否灵敏适用方面缺乏相应的参考。

生物活性^[1-3]

1）提高免疫力及抗肿瘤

抗癌是多糖类化合物的重要生物活性，具有毒副作用小、与化疗药物联用有协同效应的特点。它的活性部分是由β(1→3)键连接的主链和β(1→6)键连接而成的葡聚糖。作用机理是通过增加巨噬细胞的吞噬作用，促进免疫球蛋白形成，升高白细胞，提高淋巴细胞转化率和机体本身的抗病能力，并可增强机体对放疗、化疗的耐受性，抑制癌细胞的生长和扩大。研究结果表明猴头多糖能增加免疫功能低下的小鼠的胸腺和脾重，增加CY引起的免疫功能低下的小鼠白细胞数量，增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力，促使溶血素生成，提高小鼠血清中的溶血素的含量，表明HEP能增强免疫功能低下机体的免疫系统。猴头子实体多糖，可明显增强细胞因子L-2，显著抑制S180肉瘤的生长，对正常及异常免疫都具有调节作用，间接证明了HEPS是因为增强免疫功能而起到抗肿瘤作用，进而抑制肿瘤细胞的生长繁殖。2001年从猴头菌培养液中提取的多糖分子量大于1.5×104，具有明显的抗人造肺转移性肿瘤作用，且该多糖能使T细胞和巨嗜细胞的数量增加。据有关资料统计，用猴头菇制剂治疗134例胃癌，总有效率为78.5%。实验证明，癌症手术后及化疗患者，多吃猴头菇可增强免疫功能，达到延长患者生存期，缩小肿块的良好效果。在肿瘤治疗时，它不像一般化学药物直接杀伤肿瘤细胞，而是作为一种生物反应调节剂，促进细胞和体液免疫反应，来达到抑制和消灭肿瘤细胞的效果。猴头多糖这种靠生物反应调节间接抑制肿瘤细胞生长的方式为肿瘤免疫治疗开辟了一条新途径。

2）抗溃疡

近年临床研究证明，猴头菇菌治疗消化性溃疡的有效率为87.2%，治疗慢性胃炎总有效率为96.3%，胃及溃疡94.4%，十二指肠球部溃疡总有效率为92.7%。其作用机理是猴头菌的氨基酸和多糖成分对胃黏膜上皮的再生和修复起重要作用，能增强胃黏膜屏障机能。于成功等研究表明猴头菌对大鼠胃粘膜有保护作用。应用猴头菌片可修复损坏的胃粘膜，增加胃粘膜血流从而增强胃粘膜的防御功能，有利于减轻损伤因子的作用，还可减少或减轻粘膜下的炎细胞浸润度。同时猴头菇对胃胀、嗳气、泛酸、大便隐血、食欲不振等均有良好的治疗作用。

3）抗衰老

自由基理论认为体内产生的氧自由基能导致脂质过氧化，破坏细胞膜，杀伤细胞以及改变关节处润滑液的粘性，并由此引起细胞衰老与死亡。超氧化物歧化酶(SOD)是以氧自由基为底物的，可清除有害自由基，保护细胞免受损伤，延缓细胞衰老。众多中药多糖与真菌多糖的研究均表明，多糖能增强免疫功能、清除自由基而起到抗衰老作用。研究表明猴头多糖可增加小鼠脑和肝脏中SOD活力，明显降低果蝇和小鼠心肌脂褐质含量，增强果蝇飞翔能力，具有抗衰老、抗疲劳作用。此外研究发现猴头菇多糖可促进由刀豆球蛋白(ConA)活化的小鼠胸腺细胞(前T细胞)和脾脏淋巴细胞的增殖，能明显增强乳酸脱氢酶活性，这对于机体抗疲劳、抵御疾病和康复都有重要的意义。

4）降血糖

具有降血糖活性是许多多糖的重要生理功能。研究表明，从真菌及其他中草药中提取的80余种多糖都可使高血糖实验动物模型的血糖浓度明显降低。猴头菇多糖能明显降低血糖浓度，且对血清中甘油三酸酯和总胆固醇含量都有明显的作用效果。猴头菌多糖是一种具有降血糖活性的真菌多糖。不同多糖针对不同类型糖尿病降血糖机制不同。它们可能通过以下过程发挥作用：与细胞膜上的特定受体结合，通过第二信使cAMP将信息传至线粒体，提高糖代谢酶系的活性，加速糖的氧化分解。

5）抗辐射

猴头菇多糖还具有抗微波辐射等功能。猴头菇多糖对受815Gyγ射线照射小鼠有明显的辐射防护作用。其防护作用机制可能是与其提高机体免疫功能，增强免疫调节和保护造血组织有关。猴头菇多糖可能有望成为辐射防护药物，值得作进一步研究。此外，除上述作用，猴头菌属真菌多糖还有保肝护肝、健胃益脾、抑菌、抗凝血、抗白细胞下降、治疗神经衰弱、身体虚弱等疾病、降血脂、抗血栓、促进小鼠肾上腺神经细胞及PC12神经突细胞的生长、使神经突外延等功能。

主要参考资料

[1] 猴头菇多糖提取方法的比较

[2] 猴头菇营养液提取工艺研究

[3] 猴头菇多糖研究进展