醋酸夫替瑞林的制备

发布日期:2020/1/10 14:26:56

背景及概述[1]

醋酸夫替瑞林(Fertirelina)是一种黄体生成激素释放因子，多肽序列为Glp-His- Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-NHEt。现有醋酸夫替瑞林的合成方法中存在反应条件苛刻，成本高，收率低等缺陷。

制备[1]

醋酸夫替瑞林的合成方法：

1.制树脂：Fmoc-Pro-2-Chlorotrityl Resin。

反应器中加入50ml有机溶剂DCM，加入4.5g Fmoc-Pro-OH溶解，加入10g 2- Chlorotrityl Chloride Resin(2-CTC Resin)，浸泡，搅拌或震荡使其充分溶胀；加入10ml 有机碱N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)室温下反应3小时，抽掉。洗涤：分别采用DMF*2+DCM*2+甲醇*2进行洗涤，加入60ml甲醇搅拌或震荡反应2小时封闭树脂上未连接Fmoc-Pro-OH的活性基团。抽干，得到Fmoc-Pro-2-Chlorotrityl Resin。紫外法检测树脂替代度0.6mmol/g。

2.制备肽树脂：Pyr-His(trt)-Trp(boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Gly-Leu-Arg (pbf)-Pro-2CTC Resin。

以连接好的树脂Fmoc-Pro-2-Chlorotrityl Resin为起始。

(1)取10g树脂Fmoc-Pro-2-Chlorotrityl Resin，浸泡在100ml有机溶剂DCM中 30min，辅以搅拌使其充分溶胀。抽干，用DMF洗涤三遍，抽掉。

(2)加入100ml脱帽试剂：20％DBLK+DMF，分别反应两次，次10min，第二次5min 以去除Fmoc保护基团。然后洗涤6遍，具体洗涤顺序：DMF+甲醇+DMF+(DCM+DMF)+DMF+DMF，抽干。以DMF为溶剂，加入9.7g Fmoc-Arg(pbf)-OH，10ml DIPEA和TBTU(4.8g)+HOBT(2g)，常温下偶联2小时，茚三酮检测反应进程，偶联结束后抽掉反应液，用DMF洗涤3遍。

(3)加入100ml脱帽试剂：20％DBLK+DMF，分别反应两次，次10min，第二次5min 以去除Fmoc保护基团。然后洗涤6遍，具体洗涤顺序：DMF+甲醇+DMF+(DCM+DMF)+DMF+DMF，抽干。以DMF为溶剂，加入5.3g Fmoc-Leu-OH，10ml DIPEA和TBTU(4.8g)+HOBT(2g)常温下偶联 2小时，茚三酮检测反应进程，偶联结束后抽掉反应液，用DMF洗涤3遍。

(4)加入100ml脱帽试剂：20％DBLK+DMF，分别反应两次，次10min，第二次5min 以去除Fmoc保护基团。然后洗涤6遍，具体洗涤顺序：DMF+甲醇+DMF+(DCM+DMF)+DMF+DMF，抽干。以DMF为溶剂，加入4.5g Fmoc-Gly-OH，5ml DIC和2g HOBT，29度下偶联2小时，茚三酮检测反应进程，偶联结束后抽掉反应液，用DMF洗涤3遍。

(5)加入100ml脱帽试剂：20％DBLK+DMF，分别反应两次，次10min，第二次5min 以去除Fmoc保护基团。然后洗涤6遍，具体洗涤顺序：DMF+甲醇+DMF+(DCM+DMF)+DMF+DMF，抽干。以DMF为溶剂，加入6.9g Fmoc-Tyr(tbu)-OH，5ml DIC和2g HOBT，29度下偶联2小时，茚三酮检测反应进程，偶联结束后抽掉反应液，用DMF洗涤3遍。

(6)加入100ml脱帽试剂：20％DBLK+DMF，分别反应两次，次10min，第二次5min 以去除Fmoc保护基团。然后洗涤6遍，具体洗涤顺序：DMF+甲醇+DMF+(DCM+DMF)+DMF+DMF，抽干。以DMF为溶剂，加入5.7g Fmoc-Ser(tbu)-OH，5ml DIC和2g HOBT，29度下偶联2小时，茚三酮检测反应进程，偶联结束后抽掉反应液，用DMF洗涤3遍。

(7)加入120ml脱帽试剂：20％DBLK+DMF，分别反应两次，次10min，第二次5min 以去除Fmoc保护基团。然后洗涤6遍，具体洗涤顺序：DMF+甲醇+DMF+(DCM+DMF)+DMF+DMF，抽干。以DMF为溶剂，加入7.9g Fmoc-Trp(boc)-OH，5ml DIC和2g HOBT，29度下偶联2小时，茚三酮检测反应进程，偶联结束后抽掉反应液，用DMF洗涤3遍。

(8)加入120ml脱帽试剂：20％DBLK+DMF，分别反应两次，次10min，第二次5min 以去除Fmoc保护基团。然后洗涤6遍，具体洗涤顺序：DMF+甲醇+DMF+(DCM+DMF)+DMF+DMF，抽干。以DMF为溶剂，加入9.3g Fmoc-His(trt)-OH，5ml DIC和2g HOBT，29度下偶联2小时，茚三酮检测反应进程，偶联结束后抽掉反应液，用DMF洗涤3遍。

(9)加入120ml脱帽试剂：20％DBLK+DMF，分别反应两次，次10min，第二次5min 以去除Fmoc保护基团。然后洗涤6遍，具体洗涤顺序：DMF+甲醇+DMF+(DCM+DMF)+DMF+DMF，抽干。以DMF为溶剂，加入2g H-Pyr-OH，5ml DIC和2g HOBT，29度下偶联2小时，茚三酮检测反应进程，偶联结束后抽掉反应液。用DMF洗涤3遍，DCM洗3遍，甲醇洗3遍,其中甲醇每次8min，完成洗涤和树脂收缩。干燥得到肽树脂。

3.制备全保护肽链片段：Pyr-His(trt)-Trp(boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Gly-Leu- Arg(pbf)-Pro-OH。

配置2％的三氟乙酸(TFA)DCM混合溶液。-10℃下加入肽树脂，震荡，保持低温 15min。升温至25度，反应2.5小时。抽滤，收集滤液，加少量有机碱：N,N-二异丙基乙胺调解 pH至中性，减压旋蒸获得全保护片段PGluP-9。

4.制备全保护夫替瑞林。

将3中制得全保护片段PGluP-9溶于适量DMF中，加入PYBOP和乙胺盐酸盐。加入有机碱:N,N-二异丙基乙胺调节pH＝8.5。搅拌反应5小时.HPLC跟踪反应进程。乙胺化结束后加入饱和柠檬酸水溶液析出白色固体，抽干，干燥，得全保护夫替瑞林。

5.切除侧链得夫替瑞林粗品。

玻璃容器中加入冰切割试剂(三氟乙酸TFA：三异丙基硅烷Tris：巯基丙酸mpa：苯酚：H2O＝90：4:3:2:1)低温保持15min。加热至25度左右反应2.5h。反应结束后。加入冰无水乙醚沉淀，离心/过滤收集沉淀，再用常温无水乙醚洗涤5遍，真空干燥，得到夫替瑞林粗品。 HPLC检测纯度。称重6.94g。