双荧光素酶验证MIRNA与靶目标基因结合位点应用

双荧光素酶验证MIRNA与靶目标基因结合位点背景^[1]

双萤光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性萤光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的萤光素酶。单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响，而双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供一基准线，从而可以在程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。Dual-Luciferase双萤光素酶报告基因检测系统在细胞中同时表达萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶，两者没有种源同源性并对应不同的反应底物，故而没有交叉干扰。利用双萤光素酶报告基因系统可以对miRNA与靶目标基因结合位点，转录因子和启动子结合位点提供验证服务。

双荧光素酶验证MIRNA与靶目标基因结合位点应用^[1]

由于miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用，可以将目的基因3’UTR区域构建至载体中报告基因luciferase的后面， 通过比较过表达或者干扰miRNA后，报告基因表达的改变（监测萤光素酶的活性变化）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用；结合定点突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。实验目的:  验证hsa-mir-21与靶基因Tropomyosin 1 3’UTR是否发生作用并进一步确定hsa-mir-21与靶基因Tropomyosin 1 3’UTR的作用位点。

主要参考文献

[1] 印翠，张俊玲，施志仪，孙文慧，孙近近。应用于miRNA靶标检测的双荧光素酶报告载体的构建及鉴定。《生物技术通报》2015年 第12期 。