鲎试剂三肽的应用

背景及概述^[1]

1981年Morita从鲎血变形细胞中分离出一种酶，称G因子，同年日本学者Kakinuma等证明霉菌细胞壁中普遍存在脂多糖即(1※3)-β-葡聚糖，它可活化G因子，活化的G因子又可使凝固酶原转化成凝固酶产生凝集反应，在鲎试剂中加入鲎试剂三肽(BocLeu-Gly-Arg-PNA)，凝固酶水解鲎试剂三肽，使其释放出显色基团对硝基苯胺(PNA)，PNA在溶液中呈黄色，再加入偶氮试剂生成玫瑰红色产物，在550nm比色。在一定时间内生成的PNA量与(1※3)-β-葡聚糖浓度成正比关系，可以用分光光度计比色，根据其吸光度计算多糖浓度。

应用^[1]

鲎试剂法测定毕格犬血清中香菇多糖。

1）试剂的配制：每支鲎试剂加入无内毒素水100μL；无菌分装5mg鲎试剂三肽，加入无内毒素水5mL，漩涡混合，配成1mg·mL-1的鲎试剂三肽溶液；精密称取亚硝酸钠0.0400g，加入1mol·L-1盐酸溶液100mL，配成0.04%亚硝酸钠溶液；精密称取氨基磺酸胺0.3000g，加水100mL，配成0.30%氨基磺酸胺溶液；精密称取N-1-萘乙二胺盐酸盐0.0700g，加水100mL，配成0.07%N-1-萘乙二胺盐酸盐溶液。
2）无内毒素器材的处理：所有玻璃试管、玻璃毛细吸管及玻璃瓶泡酸过夜，自来水冲洗15遍，蒸馏水冲洗4～5遍，250℃至少烘烤4h；使用250μL和1000μL无内毒素的吸头；操作在超净工作台内完成。
3）血清样品预处理：取血清200μL放入已除内毒素的玻璃试管中，盖好玻璃塞，100℃烘箱烘烤10min，待血清成果冻状后取出，用一端封口的玻璃毛细管将果冻状的血清搅碎后，加入无内毒素水800μL，盖上玻璃塞，用封口膜密封，漩涡混合30s，(37±1)℃水浴20min，3000r·min-1离心10min，取上清液，备用。
4）测定方法：取步骤3）上清液0.1mL，以无内毒素水0.1mL稀释鲎试剂，与鲎试剂0.05mL混匀，再加入鲎试剂三肽0.05mL，混匀，置于37℃细胞培养箱内孵化30min，然后加入亚硝酸钠溶液0.5mL，混匀，分别加入氨基磺酸铵0.5mL、萘乙二胺0.5mL，混匀，于300～650nm波长处扫描，得吸收波长为550nm，于该波长处测定吸光度。
4）结果：香菇多糖浓度在5～200ng·mL-1范围内线性关系良好，相关系数0.9922；最低定量检测限为5ng·mL-1；低、中、高3种浓度的日内精密度分别为15.4%，9.8%，4.6%；日间精密度分别为14.3%，9.3%，5.9%；相对回收率为(99.1±9.8)%；绝对回收率为(99.0±4.7)%；血清样品在4℃和-20℃放置条件下7d内稳定性良好。结论：鲎试剂显色基质法具有灵敏度高，准确、快速，重复性好，经济实用等特点，可用于毕格犬血清中香菇多糖含量的测定。

主要参考资料

[1] 鲎试剂法测定毕格犬血清中香菇多糖的含量