L2大鼠肺泡上皮细胞的应用

背景^[1-3]

L2大鼠肺泡上皮细胞（大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞）分离自肺组织；Ⅱ型肺泡上皮细胞有分裂、增殖并分化为Ⅰ型肺泡细胞的潜能，故具有修复受损伤上皮的作用。

目前培养大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞的方法主要为酶消化法，动物来源主要为目前生命科学研究领域最常见、最实用、最方便的实验动物--大鼠,现有技术中要提取大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞的方法为,首先将胰酶和Ⅰ型胶原酶混合液（即消化液）注入大鼠的肺中后，把肺置于离心管中，再把装有肺的离心管置于37℃水浴缸中水浴消化20-30分钟（以达到将肺泡上皮细胞从肺泡内消化剥离的目的），每隔5分钟补充一次消化液，最后把肺切碎,加入终止液终止消化后，进行后续提取与培养操作。

Ⅱ型肺泡细胞（ATⅡ）又称颗粒肺泡细胞，散在分布于ATⅠ肺泡细胞（ATⅠ）之间及其相邻的肺泡间隔结合处。其体积较小，呈立方形，表面稍突向肺泡腔。细胞核大而圆，胞质染色较浅淡，胞质中常见空泡。

数量较ATⅠ多，ATⅡ占肺泡上皮细胞总数的14%到16%，但仅覆盖5℅的肺泡表面。ATⅡ体积比ATⅠ小很多，人约为900um3.在细胞游离面有较多的短微绒毛，尤其在细胞边缘部更多。细胞表面有MPA凝集素，对α-半乳糖残基有特异性反应。相邻细胞以紧密连接或中间连接相连，胞质内有较多的线粒体和粗面内质网，还有多泡体、溶酶体和板层体。ATⅡ是肺泡上皮细胞的“干细胞”，它的功能多样：能增殖成新的ATⅡ，还可以分化为其他上皮细胞如ATⅠ；合成和分泌表面活性物质的功能；肺水转运功能；强大的免疫功能。

应用^[4]

用于TGF-β1对Smad7基因转染大鼠肺泡Π上皮细胞表型的影响及其相关机制的研究

肺纤维化病灶内肺泡Ⅱ型上皮细胞可能通过上皮细胞向间质细胞转变(epithelial-mesenchymal transition，EMT)也可以作为MFb的部分来源。转化生长因子-β1(transforming growth factor TGF-β1)在EMT转化过程中起着重要作用。近年的研究发现Smad(Sma／Mothers Against Decapentaplegic)蛋白是TGF-β1细胞内信号转导过程中极其重要的介导分子。在TGF-β1与其靶细胞膜上的受体(Tβ-R)结合后，可激活受体性Smad2和Smad3，进而与共同通路性Smad4形成三聚体转位到核内，并在核内相关因子的共同作用下，参与上调一些与EMT相关基因的表达。在此过程中，有研究表明，表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)可能通过促生长、抑调亡作用协同TGF-β1诱导肾小管上皮EM7的完全发生。

本课题首先在体外观察TGF-β1对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞系RLE-6TN表型改变的影响及相关机制；接下来采用体外稳定细胞转基因技术，观察Smad7基因转染大鼠RLE-6TN细胞后TGF-β1对其表型改变的影响；观察TGF-β1及EGF联用对RLE-6TN细胞表型、功能改变的影响及相关机制；以明确肺纤维化时肺内成肌纤维细胞可能存在的上皮源性，探索TGF-β1／Smad信号通路在肺纤维化发生中的作用，从而进一步阐明肺纤维化的发病机制，为改善肺纤维化临床防治打好基础准备。

目的：检测TGF-β1能否在体外诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞转变(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及其相关的信号转导机制。方法：在体外培养的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(RLE-6TN)中加入TGF-β1(3ng／m1)后，于不同时间段收取细胞，分别采用Real-time PCR和Western Blot(W．B)检测上皮细胞特异性标志物(E-cad，CK19)及间质细胞特异性标志物(α-SMA、FN和Vimentin)表达的改变；W．B检测TGF-β1对RLE-6TN细胞p-SAPK／JNK、p-p38MAPK、p-ERK1／2、p-Akt及p-Smad2蛋白表达的影响；间接细胞免疫荧光法检测α-SMA的表达；TGF-β1诱导的RLE-6TN细胞形态学的改变采用倒置相差显微镜观察；超微结构的改变采用透射电子显微镜观察；其体外迁移能力的改变采用Transwell小室检测。

参考文献

[1] 李保胜.C5a诱导小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡机制的实验研究[D].第三军医大学,2006.

[2] 付泽军.大鼠肺泡上皮细胞紧密连接蛋白claudin 1、3、4与肺爆震伤致肺水肿的关系研究[D].山西医科大学,2015.

[3] 王艳霞.肺泡上皮细胞在低氧性肺动脉高压中的作用及机制研究[D].中国人民解放军空军军医大学,2018.

[4] 徐国萍.TGF-β1对Smad7基因转染大鼠肺泡Π上皮细胞表型的影响及其相关机制的研究[D].复旦大学,2007.