植物多酚氧化酶(PPO)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

植物多酚氧化酶(PPO)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中多酚氧化酶(PPO）水平。用纯化的多酚氧化酶(PPO）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入多酚氧化酶(PPO），再与HRP标记的多酚氧化酶(PPO）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的多酚氧化酶(PPO）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中多酚氧化酶(PPO）浓度。

【操作步骤】

1.标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。

4.温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。

5.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。

6.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

7.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

8.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

9.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于小麦籽粒多酚氧化酶生化特性及其控制基因的研究

多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase,PPO）是引起亚洲面条和其它面制食品酶促褐变的主要因素,发生褐变的食品是不受消费者欢迎的,所以如何选育低PPO活性品种是育种家们非常感兴趣的问题,而小麦籽粒PPO活性如何被快速、准确地检测,PPO的生化特性以及控制基因与活性的关系是育种家们急需解决的问题。选用24个小麦品种初步探讨了以邻苯二酚代替L-DOPA,按照AACC 22-85的程序检测小麦籽粒PPO活性的可能性,并选用196份小麦品种作了进一步验证;选用3个代表性品种,初步分析了小麦PPO的酶学特性;选用19、54个PPO活性差异较大的品种,分别分析了籽粒发育、萌发过程中同工酶的变化;分析了11种化学试剂在5种浓度下对100个小麦品种籽粒PPO活性的抑制和激活效应;对43条EST和7条mRNA进行了序列组装;采用2A和2D染色体上STS标记分别检测了300个F4单株和362份小麦品种的PPO等位基因变异,并分析了等位基因2AL（2A染色体上低PPO活性基因）、2AH（2A染色体上高PPO活性基因）、2DL（2D染色体上低PPO活性基因）、2DH（2D染色体上高PPO活性基因）及等位基因组成类型与籽粒PPO活性的关系,初步探讨了内含子变异对PPO活性的影响,并提出了内含子参与PPO基因表达调控的可能性。

参考文献

[1]Allelic variation of polyphenol oxidase(PPO)genes located on chromosomes 2A and 2D and development of functional markers for the PPO genes in common wheat[J].X.Y.He,Z.H.He,L.P.Zhang,D.J.Sun,C.F.Morris,E.P.Fuerst,X.C.Xia.Theoretical and Applied Genetics.2007(1)

[2]Variation in two PPO genes associated with polyphenol oxidase activity in seeds of common wheat[J].Cheng Chang,Hai-Ping Zhang,Jie Xu,Ming-Shan You,Bao-Yun Li,Guang-Tian Liu.Euphytica.2007(1-2)

[3]Polyphenol oxidase(PPO)in wheat and wild relatives:molecular evidence for a multigene family[J].Alicia N.Massa,Brian Beecher,Craig F.Morris.Theoretical and Applied Genetics.2007(7)

[4]Functional gene markers for polyphenol oxidase locus in bread wheat(Triticum aestivum L.)[J].Rosy Raman,Harsh Raman,Peter Martin.Molecular Breeding.2007(4)

[5]司红起.小麦籽粒多酚氧化酶生化特性及其控制基因的研究[D].安徽农业大学,2008.