MDBK(牛肾细胞)的应用

背景^[1-3]

MDBK(牛肾细胞)是由S·H·Madin和N·B·Darby在1957年2月18日从一只表观正常的成年牛肾脏建立的。1973年，这株MDBK(NBL-1)细胞被牛病毒性痢疾病毒(BVDV)感染；1982年，发现了一株未被BVDV感染的MDBK(NBL-1)细胞株，此细胞zui初来自ATCC1967年7月第96代的冻存管。MDBK(NBL-1)细胞的后代经NVSL检测，未发现被任何病毒污染的证据。1982年8月，R·A·Van Deusen将MDBK(NBL-1)提供给ATCC时，已传代至第110代；MDBK(NBL-1)细胞未被BVDV感染。

培养条件

1．无菌环境

无毒和无菌是体外培养细胞的首要条件。细胞在活体内，解毒系统和免疫系统可抵抗微生物或其他有害物质的入侵，但细胞在体外培养的过程中，缺乏机体免疫系统的保护而丧失对微生物的防御能力和对有害物质的解毒能力。

3.适宜的渗透压

高渗溶液或低渗溶液会引起细胞发生褶皱、肿胀、破裂。因此，渗透压是体外培养细胞的重要条件之一。多数体外培养的细胞对渗透压都有一定的耐受能力，实际应用中，260～320mmol/L的渗透压可适用于大多数细胞。

4．气体环境与pH

细胞的体外培养需要理想的气体环境，氧气、二氧化碳是细胞生存的必要条件。氧气参与细胞的三羧酸循环，为细胞生存、代谢与合成提供能量；二氧化碳既是细胞的代谢产物，是细胞生长的必需成分，又与维持培养液的pH有关。大多数细胞适宜的pH范围往往是7.2～7.4。

应用^[4][5]

用于携带口蹄疫病毒（FMDV）前导蛋白基因逆转录病毒载体的构建及其在牛肾细胞中的表达研究

构建了含有Lab基因的重组逆转录病毒载体pBPSTR1-Lab。运用脂质体转染法使该重组质粒与pVSV-G质粒共转染于GP2-293包装细胞中,收集假病毒。通过电镜观察,发现直径约为60nm,外有囊膜,衣壳呈六边形的病毒粒子存在。用假病毒感染牛肾细胞（bovine kidney cell,MDBK）,嘌呤霉素抗性筛选阳性细胞并且加入四环素抑制Lab基因的表达。

通过12天嘌呤霉素的筛选,待抗性克隆形成时,利用有限稀释法挑取单个抗性细胞克隆。将单个抗性克隆分别扩大培养后,经除去四环素诱导整合于宿主细胞基因组中的Lab基因表达,挑选出能在较短时间内使MDBK细胞发生病变的阳性细胞株进行传代培养。

利用PCR手段,证实Lab基因被整合到MDBK细胞基因组中,并能稳定地随宿主细胞传代;利用RT-PCR检测手段,证实Lab基因在无四环素的情况下能够被转录。将第35代阳性细胞除去四环素后进行诱导表达,收集均发生病变的细胞,应用Wensten-blotting检测手段鉴定Lpro的表达。

结果显示,目的蛋白与O型FMDV抗血清能特异性反应。这表明,目的蛋白具有与O型FMDV感染宿主细胞后产生的Lpro相同的活性。

参考文献

[1]Extracorporeal photopheresis:A focus on apoptosis and cytokines[J].J.Bladon,P.C.Taylor.Journal of Dermatological Science.2006(2)

[2]TIGAR,a p53-Inducible Regulator of Glycolysis and Apoptosis[J].Karim Bensaad,Atsushi Tsuruta,Mary A.Selak,M.Nieves Calvo Vidal,Katsunori Nakano,Ramon Bartrons,Eyal Gottlieb,Karen H.Vousden.Cell.2006(1)

[3]DRAM,a p53-Induced Modulator of Autophagy,Is Critical for Apoptosis[J].Diane Crighton,Simon Wilkinson,Jim O’Prey,Nelofer Syed,Paul Smith,Paul R.Harrison,Milena Gasco,Ornella Garrone,Tim Crook,Kevin M.Ryan.Cell.2006(1)

[4]Differential distribution of non-structural proteins of foot-and-mouth disease virus in BHK-21 cells[J].Mercedes García-Briones,María F.Rosas,Mónica González-Magaldi,Miguel A.Martín-Acebes,Francisco Sobrino,Rosario Armas-Portela.Virology.2006(2)

[5]周建华.携带口蹄疫病毒（FMDV）前导蛋白基因逆转录病毒载体的构建及其在牛肾细胞中的表达[D].中国农业科学院,2008.