胎儿骨髓间充质干细胞完全培养基的应用

背景^[1-3]

胎儿骨髓间充质干细胞完全培养基特别添加了能有效改善细胞生长状态的营养物质和特别甄选的优质胎牛血清，适合胎儿骨髓间质干细胞的体外培养。

培养基成分：胎儿骨髓间质干细胞基础培养基440 mL；胎儿骨髓间质干细胞专用胎牛血清50 mL；双抗5 mL；谷氨酰胺5 mL。

骨髓原始间充质干细胞是骨髓基质干细胞，是人们在哺乳动物的骨髓基质中发现的一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群。它们对骨髓中的造血干细胞（HSC）不仅有机械支持作用，还能分泌多种生长因子（如IL-6，IL-11，LIF，M-CSF及SCF等）来支持造血。

骨髓间充质干细胞具有向中胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化的能力，这些细胞包括成肌细胞、肝细胞、成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、神经胶质细胞、神经细胞、造血干细胞、基质细胞等，在两性霉素B和5-氮胞苷作用下，还可形成肌小点，骨髓间充质干细胞用于中胚层和神经外胚层来源的组织损伤及退行性病变的治疗前景巨大。

动物实验已经证实，骨髓间充质干细胞单独应用可以较好地促进骨折愈合和软骨损伤的修复，通过体外培养使其覆盖于陶瓷支架或碳纤维网络等再植入患处效果更明显。骨髓间充质干细胞体外培养，因具有黏附于塑料培养皿壁的能力而易于分享，体外经过长期连续培养和冷冻保存后不会改变其分化潜能，植入以后可以分化成造血以外的组织，如肺、软骨、骨、神经等，并表现出相应组织细胞的表型。

应用^[4][5]

用于人胎盘间充质干细胞的分离鉴定及诱导其向神经干细胞的分化研究

胎盘间充质干细胞（Human Placenta Derived Mesenchymal Stem Cells,hPDMSCs）来源丰富,采集方便,免疫原性极低,且具备多种分化潜能,有资料显示,胎盘间充质干细胞有神经分化的能力,但其分化成的神经细胞具有有限的再生能力,对其是否可以诱导分化为神经干细胞尚不清楚。

通过对人胎盘间充质干细胞的分离、培养、鉴定,研究其向神经干细胞的分化情况,为临床干细胞治疗神经退行性疾病提供理论依据。

方法:选择足月剖宫产孕妇的胎盘,通过对胎盘机械分离及酶消化的方法分离得到胎盘间充质干细胞,用含10%FBS的培养基进行细胞贴壁培养、传代及冻存,应用流式细胞技术检测胎盘间充质干细胞表面特异标志物的表达,经过成骨、成软骨及成脂诱导培养基的诱导培养21天后,用茜素红、甲苯胺蓝、油红O进行细胞染色,观察胎盘间充质干细胞的分化潜能。

将用神经营养因子bFGF、EGF添加N2和B27分三步将胎盘间充质干细胞分化为神经干细胞,待细胞长满后用0.0125%的胰蛋白酶进行消化,并对分化得到的神经干细胞进行免疫荧光检测,检测神经干细胞表面标志物的表达情况。

结果:体外分离培养人胎盘间充质干细胞形态类似成纤维细胞,呈梭形贴壁漩涡状生长,流式细胞术检测发现细胞高表达CD90、CD73C、CD105以及CD146,而CD34、CD31、CD45RA以及HLA-DR表达均为阴性。

胎盘间充质干细胞诱导21天后,经过茜素红染色后细胞出现着色为红色的钙结节,经甲苯胺蓝染色后细胞染成蓝色,经油红O染色后细胞出现红色的圆形脂滴。经神经诱导后,细胞胞体缩小,折光性变强。

由成纤维状细胞变为大小不等的球形细胞生长,经免疫荧光检测,由胎盘间充质干细胞不表达SOX1、PAX6和Nestin,而分化成的神经细胞干细胞高度表达SOX1,PAX6和Nestin。

参考文献

[1]Human umbilical cord blood‐derived mesenchymal stem cells improve functional recovery through thrombospondin1,pantraxin3,and vascular endothelial growth factor in the ischemic rat brain[J].Hyung Woo Park,Hyo‐Eun Moon,Hye‐Soo R.Kim,Seung Leal Paek,Yona Kim,Jong Wook Chang,Yoon Sun Yang,KwanWoo Kim,Wonil Oh,Jae Ha Hwang,Jin Wook Kim,Dong Gyu Kim,Sun Ha Paek.Journal of Neuroscience Research.2015(12)

[2]Wake-active neurons across aging and neurodegeneration:a potential role for sleep disturbances in promoting disease[J].Anna L Stern,Nirinjini Naidoo.SpringerPlus.2015(1)

[3]Pathogenic Mechanisms of Neurodegeneration in Parkinson Disease[J].Stephen Mullin,Anthony H.V.Schapira.Neurologic Clinics.2015(1)

[4]Why Alzheimer trials fail:removing soluble oligomeric beta amyloid is essential,inconsistent,and difficult[J].William I.Rosenblum.Neurobiology of Aging.2013

[5]田鑫.人胎盘间充质干细胞的分离鉴定及诱导其向神经干细胞的分化[D].河北医科大学,2019.