基因转染增强剂使用方法

Polybrene (hexadimethrine bromide)（聚凝胺）又名溴化己二甲铵、海美溴铵，CAS号：28728-55-4。聚凝胺是一种多聚阳离子聚合物，常用于哺乳动物细胞的 DNA 转染实验以增强转染效率。其增强转染效率原理图如下：
 

本产品具有如下特点：

1.　Polybrene 广泛应用于脂质体转染、逆转录病毒介导的基因转染及慢病毒介导的基因转染等实验，可以显著提高各种逆转录病毒、慢病毒及脂质体的转染效率。如：腺病毒转染BHK-21细胞，转染率可从2.3%提高到95%。

2.　Polybrene 对某些细胞（如末端分化的神经元，DC 细胞）毒性较大，初次应用建议先做毒性测试。

3.　Polybrene还是一种有效的抗肝素剂（肝素拮抗剂），常用来生产非特异性凝集的红细胞；还可用于蛋白测序，小剂量的 Polybrene 在自动测序分析可明显改善多肽的降解现象；PVDF 膜上加入 Polybrene 能提高膜的亲和性。

基因转染增强剂(Polybrene (hexadimethrine bromide))使用及效果

慢病毒转染实验举例： 37℃过夜培养的细胞，吸去细胞原有培养基，将按照MOI稀释好的病毒液+培养基+Polybrene（对于293细胞，终浓度6μg/mL）加入细胞中，轻轻摇匀。48小时后，吸除含慢病毒的培养基，换为新鲜的培养基。继续培养24~48小时后，根据需要收集细胞检测目的蛋白的表达。

基因转染增强剂(Polybrene (hexadimethrine bromide))操作步骤

（一）获得目的基因

1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。

2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

（二）构建重组表达载体

1、基因转染增强剂(Polybrene (hexadimethrine bromide))载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

（三）  获得含重组表达质粒的表达菌种

1、 将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。

2、 测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

3、 以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

（四）诱导表达

1、 基因转染增强剂(Polybrene (hexadimethrine bromide))挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。

2、按1∶50比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌0.4-1.0（*0.6，大约需3hr）。

3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr。

4、分别取菌体1ml, 离心12000g×30s收获沉淀，用100μl 1%SDS重悬，混匀, 70℃10min。

5、离心12000g×1min，取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。