乳糖发酵对照培养基的应用

背景^[1-3]

乳糖发酵对照培养基主要用于大肠菌群复发酵试验，也可用于大肠杆菌确证试验。

大肠菌群主要包括畅杆菌科中韵埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、魔雷伯氏菌属和肠杆菌属。这些属的细菌均来自于人和温血动物的肠道，需氧与兼性厌氧，不形成芽孢；在35～37℃条件下，48小时内能发酵乳糖声酸产气，革兰氏阴性。大肠菌群中以埃希氏菌属为主，埃希氏菌属教俗称为典型大肠杆菌。

大肠菌群都是直接或间接地来自人和温血动物的粪便。本群中典型大肠杆菌以外的菌属，除直接来自粪便外，也可能来自典型大肠杆菌排出体外7～30天后在环境中的变异。所以食品中检出大肠菌群J表示食品受动人寝温血动物的粪便污染，其中典型大肠杆菌为粪便近期污染，其他菌属则可能为粪便的陈旧污染。

复发酵试验：

1、用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物dao

2、移种于煌绿乳糖胆盐肉汤BGLB)管中

3、培养条件：培养温度36℃±1℃，培养时间48 h±2 h

4、观察产气情况：产气者,计为大肠菌群阳性管。

蛋白胨作为基础营养物质提供氮源、氨基酸和其他的生长因子满足细菌生长的需求；乳糖提供碳源；溴甲酚紫作为酸碱指示剂，发酵乳糖的大肠菌群产酸，培养基pH下降，溴甲酚紫显黄色。本培养基无任何抑菌剂，适合于乳糖发酵试验，配制好的颜色为紫色透明液体。

应用^[4][5]

用于产乙醇重组大肠杆菌代谢工程改造及乙醇发酵研究

选取大肠杆菌为主要研究对象,以获得优良产乙醇菌株为目的,并以此为基础探索生物质乙醇发酵新工艺与新技术,以期改善生物质乙醇的生产效率与经济可行性。

结果:1)阻断大肠杆菌主要有机酸副产物合成途径,显著提高了其代谢葡萄糖合成乙醇的得率。在删除了甲酸、乙酸和乳酸合成途径的基础上,构建了乙醇生产菌Escherichia coli B0013-1030PA;在摇瓶发酵水平上,此菌株能够代谢25 g·L-1葡萄糖产生11.25 g·L-1乙醇,乙醇得率为理论得率的86.0%,较对照提高了15.7%;此菌株在乙醇发酵的同时,合成并积累2.37 g·L-1琥珀酸,0.18 g·L-1乙酸,乳酸和甲酸未被检出。

进一步删除其琥珀酸合成途径关键酶基因frdA,获得菌株E.coli B0013-1031PA;在摇瓶发酵水平上,此菌株能够代谢25 g·L-1葡萄糖产生11.90 g·L-1乙醇,达到理论得率的93.0%,仅合成与积累0.12 g·L-1琥珀酸。

2) 解析了E.coli B0013利用木糖生长缓慢的遗传本质,进而通过同源重组修复了其木糖代谢。以木糖为唯一碳源,E.coli B0013的比生长速率为0.17 h-1,仅为对照菌株E.coli K12比生长速率(0.35 h-1)的48.6%;在E.coli B0013中表达E.coli K12木糖运输操纵子xylFGH后,菌株利用木糖的比生长速率恢复到0.32 h-1;克隆E.coli B0013的xylFGH并进行序列测定与分析,xylH的第126位密码子突变为终止密码子TAG,引起xylH的读框提前终止;

通过分子克隆与同源重组,将E.coli K12的xyl H部分片段（117 bp-462 bp）转入E.coli B0013,筛选获得了xylH回复突变株E.coli B0013H,其xylH的第126位密码子由TAG回复突变为TGG,此菌株利用木糖的比生长速率为0.33 h-1,接近E.coli K12。可见,E.coli B0013的xylH发生无义突变,使其丧失了木糖主要运输功能,木糖代谢变缓;回复突变xylH后恢复了其木糖快速利用能力。

参考文献

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[4]Simultaneous fermentation of glucose and xylose at elevated temperatures co-produces ethanol and xylitol through overexpression of a xylose-specific transporter in engineered Kluyveromyces marxianus[J].Biao Zhang,Jia Zhang,Dongmei Wang,Ruixiang Han,Rui Ding,Xiaolian Gao,Lianhong Sun,Jiong Hong.Bioresource Technology.2016

[5]孙金凤.产乙醇重组大肠杆菌代谢工程改造及乙醇发酵[D].江南大学,2018.