犬血管紧张素转化酶(ACE)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

犬血管紧张素转化酶(ACE)ELISA KIT是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的实验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体-聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。

犬血管紧张素转化酶(ACE)ELISA结果图

操作步骤：

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。给酶标板覆膜，37℃孵育2小时。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体，甩干，每个孔中加入Detection Ab工作液100μl(在使用前15分钟内配制)，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。

3.弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约350μl/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。

4.每孔加HRP Conjugate工作液(临用前15分钟内配制)100μl，加上覆膜，37℃温育1小时。

5.弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3。

6.每孔加底物溶液100μl，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15分钟左右(根据实际显色情况酌情缩短或延长，但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时，即可终止)。

7.每孔加终止液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。

8.立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。应提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。

9.实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存至有效期结束。

应用^[4][5]

用于动物组织血管紧张素转化酶的提取纯化及其工艺优化研究

血管紧张素转化酶（Angiotensin Converting Enzyme,ACE;EC.3.4.15.1）是一种二肽羧基的糖蛋白酶,在血压调节中起重要作用。进一步深入研究ACE的结构功能、生化性质、与其抑制剂结合作用等需要大量ACE原料,能否获取大批量高活性的ACE非常关键。

分别从猪肺和兔肺中分离纯化得到ACE,对各纯化步骤的产物进行酶活测定,相对之前报道中的方法,提出了新的优化的工艺,使获得大批量高回收率的ACE成为了可能。

主要结果如下：以新鲜猪肺为原材料,用硼酸缓冲液进行匀浆后,加入胰蛋白酶与37℃下水浴加热反应一小时后进行离心,分别用1.6mol·L-1和2.6mol·L-1两种不同浓度的硫酸铵来进行分级沉淀并透析。然后选择大负载量的DEAE阴离子交换自装柱进行层析,通过优化上样量、洗脱液盐浓度、pH和流速,得到层析条件,获得了高回收率的酶。

经测定所得ACE的比活力为0.1303U·L-1,纯化倍数为39.48倍,酶活回收率为59.14%,其分子量为69kDa,这为后续的继续纯化和其他研究工作提供了丰富的原材料,奠定了良好的基础。参照猪肺ACE的纯化方法对兔肺ACE进行分离纯化,可以得到比活力为0.1308U·L-1的兔肺ACE,纯化倍数为31.90倍,酶活回收率为45.20%。

对猪肺ACE和兔肺ACE分别进行酶学性质进行考察,可知两种ACE的活力与pH和温度之间的关系：在偏中性或者弱碱性的环境下,两种ACE均表现出较高的活力,其中最适pH均为8.3；而不同温度的条件对ACE活性的影响更为突出,在42℃时两种ACE活性均最强,高于或低于此温度ACE活性出现明显下降。

通过ACE在与不同浓度下的HHL底物反应得出的反应动力学曲线和Lineweaver-Burk方程计算得到：猪肺血管紧张素转化酶Km为1.521mmol·L-1,Vmax为17.301nmol·min-1；兔肺血管紧张素转化酶Km为1.058mmol·L-1,Vmax为12.107nmol·min-1。

参考文献

[1]Purification and biochemical characterization of angiotensin I-converting enzyme（ACE）from ostrich lung:The effect of 2,2,2-trifluoroethanol on ACE conformation and activity[J].Zahra Mojallal-Tabatabei,Ahmad Asoodeh,Mohammad Reza Housaindokht,Jamshidkhan Chamani.Process Biochemistry.2013(7)

[2]Isothermal titration calorimetry of membrane proteins—Progress and challenges[J].Krishna Rajarathnam,J?rg R?sgen.BBA-Biomembranes.2013

[3]Molecular mechanism of the interactions between inhibitory tripeptides and angiotensin-converting enzyme[J].Min Zhou,Kun Du,Peijun Ji,Wei Feng.Biophysical Chemistry.2012

[4]Automated multi-step purification protocol for Angiotensin-I-Converting-Enzyme（ACE）[J].Thomas Eisele,Timo Stressler,Bertolt Kranz,Lutz Fischer.Journal of Chromatography B.2012

[5]涂振兴.动物组织血管紧张素转化酶的提取纯化及其工艺优化[D].广西大学,2014.