MIRNA提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

MIRNA提取试剂盒专用于从各种动物组织、植物组织、细胞、血清、血浆等样本中分离纯化miRNA，还可以提取siRNA，snRNA等其他小于200nt的小分子RNA，同时也可用于总RNA的提取。

本品将酚/胍裂解技术和硅基质膜纯化技术相结合，独特的裂解液在有效抑制RNases的同时，可以通过有机抽提的方法除去细胞或组织样品中的大部分DNA和蛋白。对于一些敏感的下游实验中，如需富集miRNA可适用该试剂盒单独对miRNA进行富集。

MIRNA提取胶图

本品适用样本范围广，制备的RNA纯度高，可直接用于敏感的下游应用，如Northern Blot分析，Real-Time PCR，Microarray Analysis等。

MicroRNA是一类在进化上高度保守、在生命有机体的发育过程中具有重要的调控功能的非编码小分子RNA,大小约为18-22个碱基。miRNA通过与靶基因的3’非翻译区完全或者不完全的碱基互补配对结合,发挥对靶基因mRNA的抑制或者转录后调控使功能蛋白降解的作用。在动物的胚胎早期发育、动植物细胞增殖、分化和凋亡等一系列生物学过程中,MicroRNA都发挥着极其重要的作用。

样品处理：

①组织：将组织在液氮中磨碎。每30-50 mg组织加1ml TRIzon Reagent，震荡混匀。样品体积不超过TRIzon Reagent体积的十分之一。

②单层培养细胞：吸去培养液，加入TRIzon Reagent，每10cm2加入1ml TRIzon Reagent(裂解液用量视培养瓶面积而定)。

③细胞悬液：离心得到细胞沉淀，弃上清。每5×106-1×107细胞加入1ml TRIzon Reagent(细胞不需洗涤)。

④血浆或血清：取200μl血浆或血清样本，加入5倍体积TRIzon Reagent，震荡混匀30秒。

应用^[4][5]

用于猪骨骼肌发育中相关miRNA的鉴定及miR-21生物学功能研究

利用小鼠成肌细胞系C2C12过表达或抑制miR-21,首次发现并证实了miR-21能显著促进成肌细胞的增殖。随后,利用生物信息学方法预测并鉴定出miR-21的一个靶标基因TGFBI,提示miR-21是通过调控TGFB/AKT-mToR信号通路调控骨骼肌的发育。

首先在小鼠个体水平上检测了miR-21的表达水平,随后建立了C2C12细胞体外分化模型,通过对miRNA-21在分化0天、1天、3天和5天表达量的定量检测,发现miRNA-21在C2C12分化过程中表达显著下降。

应用免疫荧光检测方法分析miRNA-21对C2C12细胞增殖的作用,结果表明过表达以后48小时miRNA-21显著促进了细胞的增殖；而抑制掉miRNA-21之后,细胞的生长于48小时明显减缓,表现为有丝分裂marker基因P-H3的变化上。利用TargetScan和miRanda软件对miRNA-21的靶标进行预测,筛选出TGFBI基因（transforming growth factor induced gene）。

通过双荧光素酶报告基因实验确定了TGFBI的3’UTR（非翻译区）含有miRNA-21的结合点,同时运用qRT-PCR和western blot验证了miRNA-21在蛋白质翻译水平抑制TGFBI的表达,而不影响mRNA水平表达。

参考文献

[1]Dysregulation of the TGFBI gene is involved in the oncogenic activity of the nonsense mutation of hepatitis B virus surface gene sW182*[J].Shih Sheng Jiang,Shiu-Feng Huang,Min-Syuan Huang,Yng-Tay Chen,Hsiang-Ju Jhong,Il-Chi Chang,Ya-Ting Chen,Jer-Wei Chang,Wen-Ling Chen,Wei-Chen Lee,Miin-Fu Chen,Chau-Ting Yeh,Isao Matsuura.BBA-Molecular Basis of Disease.2014(7)

[2]Regulation of T lymphocyte activation by microRNA-21[J].Lu Wang,Liangqiang He,Rong Zhang,Xiufeng Liu,Yongzhe Ren,Zhipeng Liu,Xiangyu Zhang,Wei Cheng,Zi-Chun Hua.Molecular Immunology.2014(2)

[3]TGF-β-Induced（TGFBI）Protein in Melanoma:A Signature of High Metastatic Potential[J].Laura Lauden,Johan Siewiera,Wahid Boukouaci,Kiran Ramgolam,Samia Mourah,Celeste Lebbe,Dominique Charron,Fawzi Aoudjit,Nabila Jabrane-Ferrat,Reem Al-Daccak.Journal of Investigative Dermatology.2014(6)

[4]MicroRNA-21 is a novel promising target in cancer radiation therapy[J].Jia Liu,Hongcheng Zhu,Xi Yang,Yangyang Ge,Chi Zhang,Qin Qin,Jing Lu,Liangliang Zhan,Hongyan Cheng,Xinchen Sun.Tumor Biology.2014(5)

[5]白立景.猪骨骼肌发育中相关miRNA的鉴定及miR-21生物学功能研究[D].中国农业大学,2014.