液态发酵真菌α-淀粉酶及其制备方法

背景技术

来自微生物源的a-淀粉酶（a-1， 4-葡聚糖-4-葡糖苷水解酶酶，EC3.2.1.1)是 一类可以催化淀粉和其它直链或支链1.4-葡糖苷寡糖和多糖水解的酶。热稳定性高，能 催化淀粉等大分子中的a-l， 4键段键水解，产生分子量较小的麦芽糖糊精。完成淀粉 段键液化，因此也被称为液化型淀粉酶。

传统的淀粉糖化工业普遍采用双酶法水解淀粉制糖。即先用a-淀粉酶将淀粉 液化，再加糖化酶糖化来生产葡萄糖。目前市售a-淀粉酶的最适PH为6.5-9.0，而糖化 酶最适pH为4.5左右；显然，pH 4.0-5.0的淀粉浆须经历两次pH调节过程。这不仅使 得水解工艺操作变得繁琐，而且外源离子的引入，减低了酶的活性、影响了糖的收率、 加重了系统循环水及废水处理负担，不利于环境保护，同时增加了生产成本。

真菌a -淀粉酶是个应用于面包制作的微生物酶，它取代了麦芽是由于麦芽 中的淀粉酶含量不稳定，而且含有蛋白水解酶，真菌a-淀粉酶具有更稳定的活性而不 含蛋白酶活性，在食品加工行业中的应用效果尤为独特，不可替代。市场需求量增长迅 速，供不应求。

真菌a -淀粉酶是由米曲霉（Aspergillus oryzae)发酵产生的一种a -淀粉酶（Novo Nordisk，丹麦生产的Fungamyl)酶的最适作用温度为55℃左右；最适pH 5.5-7.0;其水解淀粉的产物主要是麦芽糖和一些低聚糖及少量的葡萄糖。适用于淀粉糖浆、低聚糖、啤 酒、烘焙食品、面制品、面粉加工等工艺过程。但其热稳定性较低，不适用于较高温度 的处理过程，例如，酿造工业用的糖浆，如果在60℃左右进行，加入酶量必须加倍，在 55℃下有可能会出现污染问题。另外，其最适pH在5.5-7.0，而不在4.5左右，故必须调 节pH。

—种最适pH较低条件下，热稳定性较高的真菌a-淀粉酶及其设备投资省、生 产能力高、工艺操作方便、酶产率高、成本较低的液态发酵真菌a-淀粉酶的制备方法。 是人们所期待的。

发明内容

本发明的目的在于避免上述现有技术中的不足之处，而提供一种最适pH较低条 件下，热稳定性较高，适应性强的真菌a-淀粉酶。

本发明的目的还在于提供一种设备投资省、生产能力高、工艺操作方便、酶产率高、成本较低的液态发酵真菌a-淀粉酶的制备方法。

本发明的目的可以通过如下措施来达到：

本发明的液态发酵真菌a -淀粉酶，其特征在于：

a.酶学特性[0012] 最适pH 6.0，稳定pH 5.5-7.0 ;最适作用温度为50°C -60°C ;

b.选用米曲霉菌种（Aspergillus oryzae)保藏于CICC编号M;3e为产酶菌种，采用液态发酵工艺制备，达到如下工艺技术指标：

 ①发酵产酶水平：27200u/ml ;

 ②压滤提取、澄清过滤、超滤、精滤后，液体酶回收率^80%，达到食品级卫生 标准。

发明人选用的米曲霉菌种（Aspergillus oryzae)保藏于CICC编号2436菌种，与自 主开发的液态发酵工艺巧妙结合，产生了意想不到的技术效果，从而完成了本发明的任务。

本发明的目的还可以通过如下措施来达到：

本发明的液态发酵真菌a-淀粉酶，其特征在于b中所述之米曲霉菌种 (Aspergillus oryzae)，保藏于CICC编号2436产酶菌种以钴60射线、超量紫外诱变处理， 能够赋予其遗传性状稳定好、产酶速度快、产酶水平高等优良特性。

本发明的液态发酵真菌a -淀粉酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤： 

a.菌种培养

培养基包括按照重量份数计的原料组分：

麦芽糖浆0-6

蛋白胨1

淀粉 0-5

麦芽糊精0-6

玉米桨2

豆饼粉 1.2-2.2

氯化钙 0.05

硫酸铵0.33 ;

按照以上配方准确称量培养基原料计10-12重量份，加水至100重量份，调节pH 5-6， 121℃灭菌30-35分钟，冷却至30°C-35°C ，接入米曲霉（Aspergillus oryzae)，保藏于 CICC编号2436菌种，得液体菌种预培养液；控制温度30°C -40°C，通风量45-60m3/h， 压力0.05Mpa-0.08Mpa，培养28-32小时，得液体菌种，备液态发酵用；

b.液态发酵

包括如下按照重量份数计的原料组分：

淀粉 0-9

豆饼粉 3-4.5

麦芽糊精0-8

玉米桨 2

磷酸二氢钾 0.5

氯化钙 0.05

硫酸铵 0.33 ;

按照以上配方准确称量发酵原料原料计10-12重量份，投入发酵罐，加水至100重量份，调节pH5-6， 12rC灭菌30-35分钟，冷却至30°C-35°C ，接入步骤a制备的米曲 霉（Aspergillus oryzae)，保藏于CICC编号2436菌种培养液，控制温度30°C-40°C ，通风 量450-600m3/11，压力0.05Mpa-0.08Mpa，搅拌下培养100-120小时，得发酵液；发酵水平 »7200u/ml ; 

c.提取 

①压滤提取[0043] 在步骤b制备的发酵液中加入硅藻土，搅拌下，混匀，然后压滤，固液分离， 得提取液，备用；

②澄清过滤[0045] 步骤①制备的提取液，计量体积、取样测定酶活力并调节pH至5.2士0.1，加入 821#硅藻土，澄清过滤，得澄清过滤液，备用；

③超滤、精滤，pH精调

将步骤②制备的澄清过滤液，超滤、精滤后，用稀释后的柠檬酸或纯碱精调pH至5.2±0.1 ;

©调配灌装

规格的要求，进行酶活力的调配，灌装，提取收率280%。

具体实施方式

本发明下面将结合实施例作进一步详述：

制备本发明的液态发酵真菌a-淀粉酶，包括如下步骤：

a.菌种培养

培养基包括按照重量份数计的原料组分：麦芽糖浆6

蛋白胨 1 

玉米桨2 

豆饼粉 1.2 

氯化钙 0.05 

硫酸铵0.33 ;

按照以上配方准确称量培养基原料计10-12重量份，加水至100重量份，调节pH 5-6， 121℃灭菌30-35分钟，冷却至30°C-35°C ，接入米曲霉（Aspergillus oryzae)，保藏于 CICC编号2436菌种，得液体菌种预培养液；控制温度30°C -40°C，通风量45-60m3/h， 压力0.05Mpa-0.08Mpa，培养28-32小时，得液体菌种，备液态发酵用；

b.液态发酵

包括如下按照重量份数计的原料组分：

淀粉 6

豆饼粉 3

玉米桨 2

磷酸二氢钾 0.5

氯化钙 0.05

硫酸铵 0.33 ;

按照以上配方准确称量发酵原料原料计10-12重量份，投入发酵罐，加水至100 重量份，调节pH5-6， 12rC灭菌30-35分钟，冷却至30°C-35°C ，接入步骤a制备的米曲 霉（Aspergillus oryzae)，保藏于CICC编号2436菌种培养液，控制温度30°C-40°C，通风 量450-600m3/11，压力0.05Mpa-0.08Mpa，搅拌下培养100-120小时，得发酵液；发酵水平 27200u/ml ; 

C.提取

①压滤提取

在步骤b制备的发酵液中加入硅藻土，搅拌下，混匀，然后压滤，固液分离， 得提取液，备用；

②澄清过滤

 步骤①制备的提取液，计量体积、取样测定酶活力并调节pH至5.2士0.1，加入 821#硅藻土，澄清过滤，得澄清过滤液，备用； 

③超滤、精滤，pH精调

将步骤②制备的澄清过滤液，超滤、精滤后，用稀释后的柠檬酸或纯碱精调pH至5.2±0.1 ;

©调配灌装

按产品规格的要求，进行酶活力的调配，灌装，提取收率^80%，符合食品级卫生标准。