植物总RNA提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

植物总RNA提取试剂盒采用高效、专一结合核酸的离心吸附柱和独特的缓冲系统,可从植物组织中快速提取总RNA,可同时处理大量不同样品。30-40分钟内即可完成反应,操作简单,提取迅速,溶液毒性小,实验安全。提取的总RNA纯度极高,没有蛋白和其他杂质的污染。

植物总RNA提取试剂盒

标准抽提步骤：

1.取600µl Buffer Rlysis-P加入1.5 ml RNase-free的离心管中备用。

2.取25~50 mg植物组织用液氮研磨成粉末，加到上述1.5 ml离心管中，立即震荡混匀。

3.65°C水浴5 min使样品完全裂解。

4.向裂解样品中加入60µl Buffer PCA，充分混匀。-20°C放置3 min。

5.室温12,000 rpm 4°C离心5 min，取上清。

6.向上清液中加入等体积酚:氯仿（体积比为25:24，pH4.5），混匀。12,000 rpm 4°C离心5 min，取上清液。sangon biotech

7.向上清液中加入等体积氯仿，混匀。12,000 rpm 4°C离心5 min，取上清液。

8.加入1/3体积无水乙醇，混匀，室温放置3 min，12,000 rpm 4°C离心5 min，小心倒掉上清。

9.用700µl的75%乙醇（请用DEPC-treated ddH2O配制）洗涤沉淀，12,000 rpm 4°C离心3 min,小心倒掉上清。

10.重复步骤9一次。

11.室温倒置10 min，尽可能使离心管中残留的乙醇彻底挥发。加入50µl的DEPC-treated ddH2O溶解沉淀，立即使用或-80°C长期保存.

应用^[4][5]

用于南瓜属植物总RNA的提取及抗氧化酶基因的扩增研究

RNA提取是研究基因分离和表达的步，从含有多酚、多糖以及次生代谢物质的植物组织中提取RNA存在很多问题，会造成RNA在提取过程中氧化、褐化、降解。为了建立一种经济快速的从南瓜属植物中提取RNA的方法，尝试了CTAB法、一步法、尿素/氯化锂法、热酚法、LUG法5种方法，对他们的结果进行比较和改进之后确定了一种适合南瓜和西葫芦组织的RNA提取方法即改良CTAB法。

该方法全程只需要2h，通过用等体积的异丙醇在-20℃处理20min来沉淀RNA，用高浓度的NaCl（1.0-2.5M）和醋酸钠来有效的去除多糖类化合物，利用该方法从西葫芦和南瓜叶子以及果肉中成功的提取了总RNA。提出来的RNA很清楚的显示出28s和18s两条链，RNA的产量是210-250μg/g鲜重，A260/280是2.08-2.15，A260/230是2.0-2.12，提出来的RNA是没有多酚、多糖、蛋白质污染的高纯度的RNA。

同时验证了RNA的保存方法，将RNA沉淀浸入无水乙醇中然后放在-80℃冰箱中保存，静置6个月后RNA质量无变化。建立了一种简并引物设计的方法：在NCBI中搜索出同一个属中15种植物中同一种蛋白质的序列，然后在NCBI中找出对应的cDNA序列，利用CLCMain Workbench6，通过sequence alignment，结合引物设计的原则，设计出了南瓜和西葫芦组织中Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶基因的简并引物。

参考文献

[1]High quality RNA isolation from ployphenol-,polysaccharide-and protein-rich tissues of lentil（Lens culinaris）[J].Prasanta K.Dash.3 Biotech.2013(2)

[2]Two-step purification of Cu,Zn-superoxide dismutase from pumpkin（Cucurbita moschata）pulp[J].Xiaorong Qin,Mingjin Zhang,Jian Qin,Shiwei Yuan,Yali Hou,Jianzhong Liu.Separation and Purification Technology.2011

[3]Cysteine/cystine redox signaling in cardiovascular disease[J].Young-Mi Go,Dean P.Jones.Free Radical Biology and Medicine.2010(4)

[4]NADPH Oxidases:Functions and Pathologies in the Vasculature[J].Bernard Lassègue,Kathy K.Griendling.Arteriosclerosis,Thrombosis,and Vascular Biology.2010(4)

[5]周腾飞.南瓜属植物总RNA的提取及抗氧化酶基因的扩增[D].武汉科技大学,2013.