芽孢杆菌显色培养基的应用

背景^[1-3]

芽孢杆菌显色培养基可以从食品、临床和非临床样本的混合菌群中，通过菌落显色，分离和区分不同芽孢杆菌物种。

大部分芽孢杆菌对人和动物无害，只有炭疽芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌是例外。枯草芽孢杆菌被认为与潜在的食物中毒有关(1)。蜡样芽孢杆菌发现可使大米、淀粉类食物如土豆、奶酪等污染而导致食物中毒（3,4,5）、眼部感染和许多其他临床疾病，如脓肿形成、脑膜炎、败血症、伤口感染。许多芽孢杆菌还是食物腐败菌。

培养基包括氮源营养。甘露醇提供发酵用碳水化合物，可被酚红检测到。巨大芽孢杆菌作为发酵菌，产生黄色菌落。培养基中的显色混合物被蜡样芽孢杆菌的beta-葡糖苷酶裂解，导致蓝色菌落形成。苏云金芽孢杆菌呈蓝绿色。但蜡样杆菌菌落扁平，有蓝色中心；而苏云金杆菌边缘则为不规则。

使用方法：49.22g干粉溶1000ml蒸馏水加热煮沸使培养基完全溶化，121℃高压灭菌15分钟，冷却至45-50℃。对于选择性分离蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌，无菌加入1管复溶的芽孢杆菌选择性添加剂，混匀并倾注于无菌平皿中。

芽孢杆菌显色培养基

操作步骤：

1、按国家标准、SN标准、FDA标准或其它方法制备样品液

2、样品液在30±1℃增菌培养18-24小时；

3、取增菌液划线接种于蜡样芽孢杆菌显色培养基平板上，30±1℃培养18～24h。蜡样芽孢杆菌典型菌落为蓝绿色且菌落比较大。若24小时没有出现典型菌落，可延长培养至48小时。

4、对可疑蜡样芽孢杆菌可划线接种到营养琼脂平板上，30±1℃培养18-24小时，挑取单菌落做蜡样芽孢杆菌全套生化试验。

应用^[4][5]

用于苏云金芽孢杆菌中抗生素Zwittermicin A的分离纯化与检测研究

围绕苏云金芽孢杆菌HD-1中Zwittermicin A的分离纯化与检测方法的建立进行初步研究。首先,对苏云金芽孢杆菌HD-1扩大生产的发酵工艺进行了研究,优化了发酵条件和Zwittermicin A粗提液制备流程,为Zwittermicin A的分离纯化奠定了基础。

发酵条件为：采用气升式发酵罐培养,选择大豆分离蛋白培养基为发酵培养基,培养温度为30℃,发酵时间为36h,培养基初始pH为7.5。其次,选用非极性大孔树脂LX-68M初步纯化。

大孔树脂纯化条件为：选择非极性大孔树脂LX-68M,静态吸附3h,去离子水洗脱6BV,收集后减压浓缩,回收率为87%。再次,用硅胶柱层析进行二次纯化,根据ZwittermicinA与茚三酮的显色反应,以及草生欧文氏杆菌对其敏感等特点,进行活性物质的跟踪监测并收集。

硅胶柱层析纯化条件：选择100～140目硅胶,湿法装柱,干法上样,柱床高度为40cm,上样体积为5mL,洗脱剂为乙酸乙酯：甲醇=70：30（V／V）,流速0.5mL/min。最后,对纯化后样品用分析型HPLC-MS进行纯度分析,ESI-MS进行分子量鉴定,最后得到纯度为89%的Zwittermicin A精制品约90mg（1L发酵液）。

从而建立了一种效能高,成本低,可重复性强的Zwittermicin A精制品回收工艺,为Zwittermicin A标准品的半制备提供了前提条件。本研究建立了3种ZwA含量的检测方法。首先是相对含量检测法,ZwA含量与抑菌圈的直径存在良好的线性关系,根据抑菌圈直径大小来计算ZwA相对含量。

其次是HPLC检测方法,色谱条件为反相C18分析柱,流动相为水：甲醇=85：15（V/V）,紫外检测器,检测波长210nm,流速为0.5mL/min,进样量10μL,柱温35℃,保留时间为10.0～10.5min,检测出Zwittermicin A精制品的纯度为89%。

最后是以腐胺为标准品,建立了茚三酮显色法测Zwittermicin A含量。其中,HPLC检测条件的建立为Zwittermicin A的HPLC半制备奠定了基础,以腐胺为标准品的茚三酮显色法测,也解决了由于没有标准品而无法定量测定Zwittermicin A含量的障碍,为今后关于Zwittermicin A纯化的进一步研究以及其作为增效因子在生物防治中的应用奠定了基础。