上皮中性粒细胞激活肽78(ENA78)重组蛋白的应用

背景^[1-3]

上皮中性粒细胞激活肽78(ENA78)重组蛋白是将ENA78基因通过基因工程转入大肠杆菌表达体系内表达出的重组蛋白。

重组蛋白其获得途径可以分为体外方法和体内方法。两种方法的前提都是应用基因重组技术，获得连接有可以翻译成目的蛋白的基因片段的重组载体，之后将其转入可以表达目的蛋白的宿主细胞从而表达特定的重组蛋白分子。

以利用转基因动物的乳腺表达重组蛋白为例：其方法是将药用蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，通过显微注射等方法，导入哺乳动物（哺乳动物才会泌乳）的受精卵中，然后，将受精卵送入母体内，使其生长发育成转基因动物。转基因动物进入泌乳期后，可以通过分泌的乳汁来生产所需要的蛋白质药品，因而称为动物乳腺生物反应器或乳房生物反应器。科学家已在牛和山羊等动物的乳腺生物反应器中表达出了抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素和α-抗胰蛋白酶等重要的医药产品。

当前重组蛋白的生产主要有四大系统;1.原核表达系统：最常用的大肠杆菌蛋白表达，真核表达系统如酵母，哺乳动物细胞蛋白表达（常用的细胞CHO，HEK293）及、昆虫细胞蛋白表达系统。重组蛋白的产生尚可利用转基因动物的乳腺或者植物产生，产生的重组蛋白作为生物制药的产物，在医学中作用显著。

上皮中性粒细胞激活肽78(ENA78)

上皮中性粒细胞激活肽78(ENA78)重组蛋白方法

1.载体构建和细菌培养

1)采用RT-PCR扩增得到目的基因,构建到表达载体(PGEX-4T-1)上;

2)用构建质粒转化表达菌BL21,LB平板37℃;

3)LB平板上挑取单一菌落接入5mL LB培养基(100ug/mL Amp)中,37℃培养3~5h;

4)将5mL菌液接入1L LB(100ug/mL Amp)液体培养基中,37℃培养至OD60≈0.6,加入0.3mmol/L的IPTG,

5)16℃诱导16h;

6)将培养好的菌液于5000r/min离心10min,弃去上清液,收集菌体,离心后菌体沉淀悬浮于25mL Binding buffer中。

2.细胞破碎和蛋白分离

1)往悬浮好的菌液中加入适量蛋白抑制剂(10uL的10mg/mL antipain,10uL的10mg/mL leupeptin和1mL

2)的1mol/L PMSF),冰浴放置;

3)超声破碎,每个循环26次,超声6s,间隔5s,视破碎效果共2~4个循环,破碎后的菌体4℃1800r/min

4)离心30min,上清保持在4℃;

5)GST柱先用PBS缓冲液平衡,上样结合30~60min,每5~10min搅拌一次,流干;

6)用2~3倍体积PBS缓冲液平衡清洗非特异性蛋白,流干,加入15mL洗脱缓冲液洗脱;

7)由于残存少量蛋白酶,洗脱出来的目的蛋白溶液可于4℃保存几小时;

8)SDS-PAGE检测初步纯化效果,进行下一步纯化步骤。

应用^[4][5]

用于上皮来源的中性粒细胞激活肽-78与慢性阻塞性肺疾病的相关性研究

通过测定慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者痰诱导液中上皮来源的中性粒细胞激活肽-78（ENA-78）的表达水平,探讨上皮来源的中性粒细胞激活肽-78在慢性阻塞性肺疾病发病机制中可能的作用。

方法应用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）,检测38例COPD患者（急性加重期21例,稳定期17例）痰诱导液中ENA-78的浓度,并与健康人20例进行比较,分析ENA-78与COPD的关系及相关性。结果与稳定期组和正常组比较,COPD急性加重期组的中性粒细胞明显增多（P＜0.01）;COPD急性加重期患者痰诱导液中ENA-78的表达（145.24±10.39ng/L）明显高于另外两组[COPD稳定期（74.22±23.15 ng/L）,健康组（70.51±22.44 ng/L）],差异有显著性（P＜0.001）。

结论ENA-78参与了COPD的炎症过程,在COPD急性加重期的发病机制中起重要作用。在COPD急性加重期ENA-78对中性粒细胞的募集起重要作用。

参考文献

[1]Epithelial Cell-Derived Neutrophil-Activating Peptide-78 Is Present in Fetal Membranes and Amniotic Fluid at Increased Concentrations with Intra-amniotic Infection and Preterm Delivery1[J].J.A.Keelan,J.Yang,R.J.Romero,T.Chaiworapongsa,K.W.Marvin,T.A.Sato,M.D.Mitchell.Biology of Reproduction.2004(1)

[2]Chemokine Receptors in Airway Disease:Which Receptors to Target?[J].Charles Owen.Pulmonary Pharmacology&Therapeutics.2001(3)

[3]Monocyte chemoattractant protein 1,interleukin 8,and chronic airways inflammation in COPD[J].Willem I.de Boer,Jacob K.Sont,Annemarievan Schadewijk,JanStolk,J.Hanvan Krieken,Pieter S.Hiemstra.J.Pathol..2000(5)

[4]ENA-78 is an important angiogenic factor in idiopathic pulmonary fibrosis.Keane MP,Belperio JA,Burdick MD,et al.American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine.2001

[5]盛宝巍.上皮来源的中性粒细胞激活肽-78与慢性阻塞性肺疾病的相关性研究[D].兰州大学,2009.