新琼二糖的应用及制备

背景及概述^[1][2]

琼胶广泛存在于江蓠、石花菜等红藻的细胞壁，是一种重要的海藻多糖。琼胶结构复杂，由1,3连接的β-D-半乳吡喃糖和1,4连接的3,6-内醚-α-L-半乳吡喃糖残基反复交替连接组成骨架，并包含硫酸基、甲基等取代基。琼胶酶是指一类能够降解琼胶，生成琼胶寡糖的糖苷水解酶，其主要来源是海洋细菌，少部分来源于陆地环境中的细菌和海洋软体动物。琼胶酶分类方式多样，根据琼胶酶降解琼脂糖时作用的糖苷键和产物的不同，琼胶酶可分为两大类：α-琼胶酶和β-琼胶酶。琼脂糖(agarose)可被琼脂水解酶(α-agarase及β-agarase)水解成琼寡糖(agaro-oligosaccharides)及新琼寡糖 (neoagaro-oligosaccharides)，这些寡糖类的物质已被报导具有多种不同的功能，包含抗氧化、抗炎、抗癌、保湿及美白等多种用途，另外琼寡糖具有低热量的特性，可减缓饮食淀粉的代谢，并促进乳酸菌等益生菌的生长，所以是一种非常良好的食品添加剂，可作为保健食品用途。

应用^[3-4]

琼寡糖包括新琼二糖具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等多种生物活性，并且与寡糖的聚合度(DP)密切相关。DP在2–4的寡糖可以抑制前列腺素E2(PGE2)和肿瘤坏死因子(TNF-d)的产生，从而抑制癌细胞的发生；可以通过阻止可诱导性NO合成酶(iNOs)的表达来抑制过量NO自由基的产生，从而消除NO过量造成的损伤；日本Kobayashi等发现低分子量的新琼二糖具有良好的吸湿和美白双重功效。Aga3311降解琼胶的主要产物和终产物都为新琼二糖，而之前报道的琼胶酶的主要产物多为新琼四糖，还有一些琼胶酶的主要产物是新琼六糖和新琼四糖，但终产物是新琼二糖。如有研究采用琼寡糖制备一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，该抑制剂具有下式的低聚寡糖结构，来自于红藻琼胶的降解产物，其中为n为1至10：

上述的低聚寡糖是来自于红藻琼胶的降解寡聚糖，以5个琼二糖或新琼二糖的聚合单位以下的寡糖为主，即1≤n≤5。可以进一步开发成为作为治疗与预防II型糖尿病的新型药物及保健食品上应用。

制备^[3]

1）重组琼胶酶Aga3311的纯化：按1 %的接种量将重组菌接种入50 mL LB培养基中，37 °C、150 r/min摇床培养至OD600为0.6–0.8时，加入0.8 mmol/L的 IPTG分别于15 °C和37 °C条件下进行诱导。诱导后的菌液分别于4 °C、7500 r/min离心15 min弃上清；用pH 7.4的PBS缓冲液重悬菌体，高压细胞破碎仪破碎细胞，4 °C、10000 r/min离心10 min，收集上清备用。采用Ni-NTA His Tag Kit对重组酶进行纯化，依次用含不同浓度咪唑 (20、50、100、200、500 mmol/L)的洗脱液对Ni-NTA柱进行洗脱，收集、合并洗脱峰，SDS-PAGE检测蛋白纯度。

2）降解产物分析：将重组酶1 mL与底物1 mL (0.2 %的琼脂溶于pH 7的磷酸缓冲液)在35 °C条件下，分别反应15 min、30 min、1 h、6 h，沸水浴5 min终止反应，离心备用。TLC分析结果显示，重组酶Aga3311和底物反应15 min、30 min、1 h、6 h后的降解产物与新琼二糖的迁移率相同。为了进一步对酶解产物进行验证，我们对重组酶Aga3311的酶解产物进行了MS分析，测得的离子峰(m/z)分别为： 325.2[M+H]+、342.3[M+NH4]+、347.3[M+Na]+和363.2[M+K]+，该分析结果与新琼二糖标准品的质谱结果相符。

主要参考资料

[1] CN201710565548.4 一种具热稳定性且耐高盐的琼脂水解酶

[2] CN201510205610.X 一β-琼胶酶及其应用

[3] 刘秀萌, 李江, 侯旭光, 等. 南极菌产琼胶酶 aga3311 的表达, 性质及其降解特性[J]. 微生物学报, 2016, 56(9): 1468-1476.

[4] CN02111991.0 一种α-葡萄糖苷酶抑制剂及其应用