小鼠血清总补体的应用

背景^[1-3]

小鼠血清总补体是分离自小鼠抗凝血血清的免疫补体，主要用于检测小鼠模型的免疫研究。

补体是一种血清蛋白质，存在于人和脊椎动物血清及组织液中，不耐热，活化后具有酶活性、可介导免疫应答和炎症反应。可被抗原-抗体复合物或微生物所激活，导致病原微生物裂解或被吞噬。可通过三条既独立又交叉的途径被激活，即经典途径、旁路途径和凝集素途径。

脊椎动物血液或新鲜制备的血清中存在的血清蛋白质系统，由血浆补体成分、可溶性和膜型补体调节蛋白、补体受体等30余种糖蛋白组成，是一个具有精密调控机制的蛋白质反应系统，或多分子系统，包括可溶性蛋白、膜结合性蛋白和补体受体，故称为补体系统。根据补体系统各成分的生物学功能，可将其分为补体固有成分、补体调控成分和补体受体(CR)。

小鼠血清总补体

补体C3（C3）和补体C4（C4）在血清中的含量高于其他补体分子，二者在完成补体系统的多种功能中具有十分重要的作用，实验室测定对于疾病的诊断、治疗和病因探讨具有重要作用。C3正常参考值为0.9～1.8 g/L，C3增高常见于各种传染病、急性炎症和组织损伤、急性肾炎、肝癌等，类风湿性关节炎患者正常或略有升高。C3降低常见于：免疫复合物引起的增殖性慢性肾小球肾炎（MPGN）、急性链球菌感染后肾小球肾炎（AGN）、狼疮性肾炎、反复性感染、皮疹、肝炎、肝硬化等严重肝脏疾患和关节疼痛等。C4正常参考值为0.1～0.4 g/L，C4增高常见于各种传染病、急性肾炎、组织损伤、多发性骨髓瘤等。C4降低常见于免疫复合物引起的肾炎、系统性红斑狼疮、病毒性感染、狼疮性症候群、肝硬化、肝炎等。

应用^[4][5]

用于东方田鼠补体C3和C5分子鉴定及C3靶向重组腺相关病毒构建研究

通过RACE及巢式PCR克隆了东方田鼠补体C3和C5完整基因序列。克隆的东方田鼠C3基因ORF含4988bp,编码1662个氨基酸。C3蛋白N端具有一个24个氨基酸组成的信号肽,没有跨膜区,是极不稳定的亲水性蛋白。C5蛋白由5481bp核酸编码的1688个氨基酸组成,氨基端有25个AA组成的信号肽,是稳定的亲水性蛋白。结构域分析结果显示C3蛋白有8个主要的结构域,C5蛋白有10个主要的结构域,二者结构域相似,多为A2M家族的A2M、A2M＿N、A2M＿N＿2和MG1等,都存在过敏毒素ANATO结构域。通过序列比对及进化树分析可知东方田鼠补体蛋白C3和C5均与草原田鼠的C3和C5蛋白亲缘关系较近,两种蛋白在进化过程中比较保守。

应用qPCR检测C5分子在东方田鼠各主要器官的表达水平及C3和C5分子在东方田鼠感染日本血吸虫尾蚴后动态表达水平。在正常的东方田鼠体内,C5在肝脏中表达最高。东方田鼠感染日本血吸虫尾蚴后1d,肝脏和肺脏组织C3表达水平迅速升高,比未感染组高约94%和72.9%,感染后7d和14d较未感染组降低,感染后21d和28d和未感染组比升高或接近。和未感染鼠相比,补体C5基因在感染1d和7d的肝脏和肺脏中表达水平升高,感染后第14d,表达水平降低,至21d和28d,两者转录水平接近。

结果表明C3和C5在肺肝组织中随感染进程是升高-降低-回升（接近）的过程。东方田鼠感染尾蚴1 d、7 d、14 d、21 d、28 d和42 d的血清总补体活性CH50平均值分别为433 U/mL、395 U/mL、378 U/mL、411 U/mL、373 U/mL、555 U/mL和433 U/mL,结果表明东方田鼠感染血吸虫后血清补体活性没有显著变化。

根据东方田鼠补体C3基因序列设计C3靶向的3条ShRNA序列,构建了3种重组腺相关病毒,病毒滴度为1011 GC/ml以上。rAAV8-sh RNA5-MfC3和scramble可以高效感染293T细胞,也可以感染Hepa1-6细胞,细胞感染后可见荧光信号,结果表明构建的重组病毒可以在肝细胞中表达。

Km鼠注射scramble与rAAV8-shRNA4-MfC3病毒4周后,其肝脏组织可见明显的荧光信号,肾脏组织中scramble有明显荧光,rAAV8-shRNA4-MfC3的荧光信号较弱。定量PCR检测结果显示,rAAV8-shRNA4-MfC3重组病毒可诱导肝脏C3表达量比scramble降低20.03%,4周后其抑制效率达62.70%（P<0.01）。结果表明,筛选到可抑制C3表达的重组腺相关病毒。

参考文献

[1]Complement Components,C3 and C4,and the Metabolic Syndrome[J].Melanie Copenhaver,Chack-Yung Yu,Robert P.Hoffman.Current Diabetes Reviews.2019(1)

[2]Complement in cancer:untangling an intricate relationship.[J].Reis Edimara S,Mastellos Dimitrios C,Ricklin Daniel,Mantovani Alberto,Lambris John D.Nature reviews.Immunology.2018(1)

[3]Characterization of Schistosoma japonicum tetraspanning orphan receptor and its role in binding to complement C2 and immunoprotection against murine schistosomiasis.[J].Ma Shuai,Zai Jinli,Han Yanhui,Hong Yang,Zhang Min,Cao Xiaodan,Han Qian,Lu Ke,Zhao Zhixin,Lin Jiaojiao,Fu Zhiqiang.Parasites&vectors.2017(1)

[4]Immediate,Complete,and Sustained Inhibition of C5 with ALXN1210 Reduces Complement-Mediated Hemolysis in Patients with Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria（PNH）:Interim Analysis of a Dose-Escalation Study[J].Lee Jong Wook,Bachman Eric Scott,Aguzzi Rasha,Jang Jun Ho,Kim Jin Seok,Rottinghaus Scott T.,Shafner Lori,Szer Jeff.Blood.2016(22)

[5]黄明月.东方田鼠补体C3和C5分子鉴定及C3靶向重组腺相关病毒构建[D].中国农业科学院,2021.