胆固醇氧化酶的生产方法

胆固醇氧化酶（COD)是胆固醇代谢过程中关键酶，能专一性催化胆固醇转化为胆甾-4-烯-3-酮，它作为一种胆固醇检测酶应用于医疗检测领域。同时，在食品开发、抗虫基因工程、生物农药等方面也具有广泛应用价值。

生产方法

Brevibacterium sp.可以发酵生产胆固醇氧化酶，实验中对该菌种进行了底物诱导及发酵条件的优化，确定其最适培养基为(%):蔗糖0.3,酵母膏0.2,蛋白胨0.3,牛肉膏0.3,K2HPO4 0.1,MgSO4 0.05,pH6.8.最适培养条件为:接种量5%,24℃培养20 h,通气量为50 mL培养基/250 mL三角瓶,200 r/min。在最适培养基及最适条件下，胆固醇氧化酶的酶活力可达到24.01U/mg，比未优化前1.71 U/mg提高了14倍。该酶具有较强的酸碱稳定性和热稳定性，最适pH为6.5，最适温度为54℃。在最适pH和温度条件下测得该酶km值为7.1×10-5mol/L。

提高胆固醇氧化酶稳定性方法

由于胆固醇氧化酶在保存、运输过程中易失活，因此提高其稳定性是该酶大量应用的基础。目前，提高酶稳定性方法主要有，蛋白质工程、固定化、添加保护剂、化学修饰等，其中固定化是较为常用的方法。戊二醛作为双功能试剂，广泛应用于酶固定化中，但考虑到操作复杂且试剂具有毒性，本实验中使用碳二亚胺法固定胆固醇氧化酶，I-乙基-(3- 二甲 基氨基丙基）碳二亚胺（EDC)是一种将氨基和羧基偶联的缩合剂，载体或蛋白羧基被碳二亚胺活化，生成中间产物，该产物再与蛋白氨基反应形成结合物。

一种提高胆固醇氧化酶稳定性方法，其特征在于，包括以下步骤：  调整胆固醇氧化酶分子游离氨基与羧基琼脂糖颗粒载体羧基摩尔比为I : 10，总羧基与交联剂I-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺摩尔比为I : 2，固定16-20小时，控制固定温度为4-10°C。