尼氏染色试剂盒(甲基紫法)的应用

背景^[1-3]

尼氏染色试剂盒(甲基紫法)主要由甲基紫染色液、分化液等组成。尼氏物质呈紫黑蓝色,神经元呈淡紫蓝色,细胞核呈紫蓝色。

神经元细胞体包括一个具有皱褶核膜的大细胞核、稀疏的染色质和一个明显的核仁。在细胞体中细胞质是尼氏颗粒，即能够代表粗面内质网并在很多神经元中产生特异的斑点状嗜碱性表现的嗜碱性颗粒。

尼氏染色图

尼氏颗粒可以用很多染色来显示如中性红、亚甲基蓝、甲苯胺蓝和甲基紫等。染色的变异、pH和分化的时间使一些染色既可以仅突出尼氏物质，也可以显示神经元的细胞核和神经胶质。

尼氏体(Nissl body)或称尼氏小体是分布于神经细胞胞质内的三角形或椭圆形小块状物质，能被碱性染料如硫堇、亚甲蓝、甲苯胺蓝和焦油紫等染料染成紫蓝色。各种神经细胞内都含有尼氏体，但其形状、数量、分布位置常常不同。

尼氏体也存在于树突中，但不在于轴突和包体的轴丘。尼氏体会因为生理状态的变化而变化，尼氏体是神经元内合成蛋白质合成的重要部位，当神经元受到刺激后，包体内的尼氏体会明显减少。

自备材料：

1、中性福尔马林溶液

2、显微镜

3、蒸馏水

参考操作：

1、固定:可采用乙醇、Carnoy固定液或中性福尔马林溶液。

2、组织切片:石蜡切片7-10μm或25μm(见注意事项4)。

3、切片脱蜡入水。

4、用甲基紫染色液涂片，染色10-20min。

5、蒸馏水冲洗。

6、用Nissl Differentiation分化4-8s，直到大部分染色被消除。

应用^[4][5]

尼氏染色试剂盒(甲基紫法)可以用于神经干细胞移植治疗血管性痴呆大鼠的研究

大鼠神经干细胞的培养及慢病毒介导GFP转染的实验研究目的原代培养神经干细胞，并在体外继续分裂增殖、稳定传代，慢病毒介导GFP转染神经干细胞后，可做为移植的种子细胞，满足细胞移植需要。

材料与方法以健康孕15天Wistar大鼠为实验动物，体外分离并原代培养神经干细胞，之后传代培养，并进行单细胞克隆实验。免疫荧光法和免疫组化SP法对神经干细胞分进行鉴定，Lentivirus介导转染NSCs。

结果1．原代培养细胞可形成数十个细胞聚集而成的小神经球(Neurosphere)神经球逐渐增大，7天时神经球已生长成为数百个细胞的大克隆，即可传代培养。传代第7天时已再次长成为数百个细胞聚集的大克隆，将细胞连续传代，细胞的生长模式基本相同。

2．原代培养的神经球经分散﹑再扩增得到的大量神经球呈nestin抗原阳性；神经球可以分化为三种细胞，免疫荧光法和免疫组化SP法检测三种细胞分别呈NSE、CNP、GFAP阳性。

3．慢病毒介导GFP转染NSCs后，荧光显微镜下观察，可见NSCs携带绿色荧光。

结论1．从大鼠胚胎(孕15天)脑组织中分离的神经干细胞在体外可继续分裂增殖、稳定传代，可满足细胞移植需要。2．慢病毒介导GFP转染神经干细胞，标记后的神经干细胞做为移植的种子细胞，便于在动物体内进行跟踪研究。

NSCs移植治疗大鼠血管性痴呆的实验研究目的将慢病毒介导GFP标记的NSCs通过海马立体定向注射的方法移植到血管性痴呆模型大鼠，使海马周围的NSCs数量增加，用Morris水迷宫检测系统对实验大鼠作定位航行试验和空间探索实验测试，检测大鼠的学习记忆能力的改变，观察NSCs移植的治疗效果。

材料与方法月龄12～15个月健康成年Wistar大鼠，体重300～400g，用来制备血管性痴呆2VO模型；传代至第6代的Wistar大鼠神经干细胞，GFP标记后于2VO模型造模35天后海马立体定向注射移植，对假手术组、对照组、NSCs移植组海马组织切片做尼氏染色，观察病理学改变；在缺血4、9、13、17周（移植前和移植后4周、8周、12周）时对移植前后各组大鼠行Morris水迷宫测试，对定位航行实验和空间探索实验结果进行统计分析。

结果1．神经干细胞移植1周后，大鼠海马区冰冻切片显示有绿色荧光存在，证明神经干细胞可在海马区域存活、增殖。

2．缺血4周时（移植前），NSCs移植组与对照组大鼠各项指标均无显著性差异，但二者与假手术组相比均有显著性差异。缺血9、13、17周（移植后4周、8周、12周）时，NSCs移植组大鼠逃避潜伏期较对照组均明显缩短（P<0.05），但与假手术组相比仍明显延长；NSCs移植组穿越平台区次数较对照组也明显增加（P<0.05），与假手术组相比仍明显减少(P<0.01)；NSCs移植组大鼠平台所在象限停留的时间百分比较对照组明显增加（P<0.05，移植后12周除外），但与假手术组相比仍明显减少(P<0.05)。

3．NSCs移植组尼氏染色显示神经元丢失、变性情况较对照组有明显改善，神经元细胞形态较完整，胞浆内尼氏小体相对较丰富。结论神经干细胞移植到VaD大鼠模型中后，可在一定程度上改善VaD大鼠学习记忆能力。

参考文献

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[5]孙桂芳.神经干细胞移植治疗血管性痴呆大鼠的研究[D].郑州大学,2014.