A2780的应用

背景^[1-3]

A2780人卵巢癌细胞系来自未治疗患者的肿瘤组织。细胞作为单层生长并悬浮在旋转培养器中。A2780是顺铂耐药细胞系A2780顺式和阿霉素耐药细胞系A2780 ADR的亲本株。

A2780人卵巢癌细胞系

A2780细胞培养操作

1）复苏A2780细胞：将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

注意：a)该细胞贴壁较慢，建议复苏、传代后让细胞贴壁48-72h后再进行后续实验操作。

b)使用0.25%(w/v)Trypsin-0.53 mM EDTA消化细胞。

c)MCF7是一种生长缓慢的细胞系，它会以松散的三维团簇的形式出现，并伴有一些漂浮的活细胞。悬浮的活细胞可以通过离心后重新加入到培养瓶中培养。在复苏后前二代该细胞会出现贴壁缓慢的情况，是正常现象。松散的三维团簇细胞慢慢会扩散形成一个扁平的单层细胞。如果生长速度比正常情况慢，可以尝试另一批FBS（即血清批次的促生长能力可能不同）。此外，将血清浓度增加到20％也可能有助于改善生长。

2）A2780细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗A2780细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1：2~3比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3）A2780细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，加1 mL血清重悬细胞，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

A2780可以用于基于高通量测序对外泌体调节卵巢癌细胞株A2780顺铂耐药性相关miRNA的筛选、鉴定及功能研究

探讨卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/DDP细胞上清来源的外泌体对其亲本细胞株A2780的影响,筛选并鉴定A2780/DDP和A2780细胞上清液中外泌体mi RNA的差异,寻找与卵巢癌顺铂耐药相关外泌体mi RNA靶点,同时在卵巢恶性肿瘤中初步探索外泌体mi RNA的相关功能及作用。

方法:1.超速离心法或试剂盒法获得A2780/DDP细胞上清来源外泌体;透射电子显微镜直接观察细胞上清提取物的形态和大小;纳米粒径分析仪检测细胞上清提取物的粒径大小;Western Blot检测细胞上清提取物表面标记蛋白指标CD63、CD9、Ep CAM及Annexin V的表达情况。

2. 将提取的A2780/DDP细胞上清来源外泌体与A2780细胞株共培养后,Western Blot检测p62、LC3-I及LC3-II等自噬相关蛋白在处理后的A2780细胞株中的表达水平;CCK8法检测处理后的A2780细胞存活率;免疫荧光显微镜观察Dil染色后的A2780/DDP细胞上清来源外泌体在Dio染色后的A2780细胞株中的摄取情况。

3. 提取A2780及A2780/DDP细胞上清来源外泌体,差异性外泌体mi RNA表达谱使用高通量测序(HTS)技术检测;相关外泌体mi RNA的靶基因使用mi RDB及Targetscan在线数据库预测;外泌体mi RNA相关功能及通路分别利用GO及KEGG数据库预测。

4. RT-q PCR验证3个在A2780/DDP中上调的外泌体mi RNA表达情况;外泌体mi RNA的关键靶基因通过PPI网络预测;卵巢癌hsa-mi R-675-3p和IC50的相关性通过GDSC数据库联合TCGA数据库预测;从UCSC-Xena平台提取卵巢癌样本,联合GENCODE数据库构建mi RNA-m RNA网络;R语言联合ESTIMATE、GSVA、CIBERSORT、MCPcounter及x Cell等5种算法预测hsa-mi R-675-3p与卵巢癌免疫微环境的相关性。

结果:1.透射电子显微镜结果显示A2780/DDP细胞上清提取物呈囊泡状,且直径在40-120nm;纳米粒径仪检测结果显示细胞上清提取物的直径在40-120nm;Western blot结果显示细胞上清提取物蛋白指标CD63、CD9、Ep CAM、Annexin V的表达均有明显增强的趋势。

2. A2780/DDP细胞上清来源外泌体与A2780细胞株共培养48h后:Western Blot显示与A2780对照组(未添加外泌体共培养)相比,A2780实验组(添加外泌体共培养)P62、LC3-I及LC3-II等自噬相关蛋白的表达水平均有增加趋势;CCK8结果显示A2780实验组48h的顺铂IC50有一定变化;免疫荧光实验结果显示A2780细胞株可摄取A2780/DDP细胞上清来源的外泌体。

3.HTS结果显示:A2780及A2780/DDP细胞上清来源的外泌体中,103个mi RNA表达上调,23个mi RNA表达下调(DE-mi RNAs的识别阈值存在两倍及以上的变化,P<0.05)。筛选10个在卵巢癌顺铂敏感细胞株A2780/DDP细胞上清中上调的外泌体mi RNA,利用在线数据库mi RDB及Targetscan预测下游靶基因,外泌体hsa-mi R-675-3p下游靶基因可使用Venny图归类。GO分析结果显示:生物过程(BP)包括细胞过程、发育过程及解剖结构发育等方面;细胞组成(CC)包括细胞过程、发育过程及解剖结构发育的调控等方面;分子功能(MF)体现在蛋白质结合、转录活性及DNA结合等方面。KEGG分析结果显示:PI3K-Akt信号通路、Wnt信号通路、Erbb信号通路等可能参与了卵巢癌耐药的过程。

参考文献

[1]Ginsenoside Rg3 Alleviates Cisplatin Resistance of Gastric Cancer Cells Through Inhibiting SOX2 and the PI3K/Akt/mTOR Signaling Axis by Up-Regulating miR-429[J].Wang Xiaofeng;He Rui;Geng Li;Yuan Jing;Fan Huijie.Frontiers in Genetics,2022

[2]Circular RNA UBAP2 facilitates the cisplatin resistance of triple-negative breast cancer via microRNA-300/anti-silencing function 1B histone chaperone/PI3K/AKT/mTOR axis.[J].Wang Leiming;Yang Xi;Zhou Fei;Sun Xuesi;Li Shulin.Bioengineered,2022(3)

[3]Therapeutic strategies to overcome cisplatin resistance in ovarian cancer[J].Song Mengdi;Cui Mingxiao;Liu Kehai.European Journal of Medicinal Chemistry,2022(prep)

[4]Patient-Derived Ovarian Cancer Spheroids Rely on PI3K-AKT Signaling Addiction for Cancer Stemness and Chemoresistance[J].Parashar Deepak;Geethadevi Anjali;Mittal Sonam;McAlarnen Lindsey A.;George Jasmine;Kadamberi Ishaque P.;Gupta Prachi;Uyar Denise S.;Hopp Elizabeth E.;Drendel Holli;Bishop Erin A.;Bradley William H.;Rader Janet S.;Pradeep Sunila;ChaluvallyRaghavan Pradeep.Cancers,2022(4)

[5]王慧慧.基于高通量测序对外泌体调节卵巢癌细胞株A2780顺铂耐药性相关miRNA的筛选、鉴定及功能研究[D].福建中医药大学,2022.