细胞线粒体分离试剂盒的应用

背景^[1-3]

细胞线粒体分离试剂盒是快速便捷分离培养细胞中的线粒体的试剂盒，分离线粒体的同时可以获得去除线粒体的细胞浆蛋白，可用于分析细胞色素C等线粒体蛋白向胞浆的释放，大部分获得的线粒体都含有完整的内膜和外膜，并具有线粒体的生理功能(如梱测线粒体膜电位)，获得的蛋白可用于SDS-PAGE、Western、双向电泳等蛋白分析。本试剂盒提供台盼蓝染色液和PMSF，可以分别判断线粒体质量和提取细胞浆蛋白。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

细胞线粒体分离试剂盒

细胞线粒体分离试剂盒操作步骤：

1.清洗：用预冷的PBS清洗细胞1次，4℃1000g离心5min，其上清。

2.裂解：沉淀用1～2ml预冷的Mitochondria Lysis buffer重悬细胞，冰浴放置10～15min，可用相差显微镜梱测膨胀的程度。

3.匀浆：把细胞悬液转移至Dounce匀浆器中，匀浆10～20次。不同细胞或不同匀浆器所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。

4.台盼蓝染色(可选)：取约2～5μl细胞匀浆液，加入30～50μl Trypan Blue Stain，混匀，显微镜观察台盼蓝染色阳性(蓝色)细胞的比例，如果阳性细胞比例不足50%，增加5次匀浆，随后再同前取样进行台盼蓝染色鉴定，当阳性比例超过50%时即可停止匀浆进入下一步，但勿过度匀浆，否则易导致线粒体的机械损伤。同时记录对于该细胞的匀浆次数，在后续实验时不必再摸索匀浆次数。

5.立即取匀浆液，加入等量Wash buffer，轻轻颠倒混匀数次。

6.4℃，1300g离心5min以去除细胞核、未破碎的细胞和大的膜碎片。

7.上清液转移至一干净离心管，4℃1000g离心5min，重复2次。

8.上清液转移至一干净离心管，4℃12000～15000g离心15min，重复1次。

9.弃上清，沉淀为线粒体，如果希望获得去除线粒体的细胞浆蛋白，应在本步骤中收集上清，并且在收集上清时注意勿触及沉淀。随后把收集的上清12000g，4℃离心10min，上清即为去除线粒体的细胞浆蛋白。

10.保存：弃上清，用适当缓冲液悬浮沉淀。如果用于线粒体酶活性或功能的分析，线粒体沉淀应重悬于Mitochondria Stock buffer；如果用于线粒体蛋白的分析，获得的细胞浆蛋白应保存于1×Protein Stock buffer，即按细胞浆蛋白：Protein Stock buffer(5×)=1:4比例混合；如果用于双向电泳，应使用恰当的保存液。

应用^[4][5]

细胞线粒体分离试剂盒可以用于钼镉联合诱导绵羊肝细胞线粒体质量控制失调的作用机制

从体内和体外两个角度探讨线粒体质量控制在钼镉联合致绵羊肝细胞线粒体损伤中的作用,体内实验以钼酸铵和氯化镉作为实验毒源,选择2月龄绵羊48只,随机分为4组,每组12只:对照组(生理盐水,Control组),钼组(45 mg/kg·BW,Mo组),镉组(1 mg/kg·BW,Cd组),钼镉联合组(45 mg/kg·BW Mo+1 mg/kg·BW Cd,Mo+Cd组),在不同处理下饲养50 d,分别在第25 d和第50d取肝脏组织进行相关实验。

体外实验用改良的两步胶原酶灌注法提取绵羊原代肝细胞并分别建立钼、镉及其联合毒理模型:对照组(Control组),钼组(600μM Mo),镉组(4μM Cd),钼镉联合组(600μM Mo+4μM Cd),以及线粒体抑制剂(Cs A,1μM)和VDAC1抑制剂(VBIT,100μM),处理24 h。利用病理组织学观察、透射电镜、免疫荧光、Clark氧电极、流式细胞术、RT-q PCR、Western blot和蛋白质组学等方法,对病理形态学、氧化应激指标(SOD、MDA、GSH-Px、CAT)、ROS水平、线粒体膜电位水平(MMP)、线粒体呼吸功能指标(RCR、OPR)、线粒体动力学相关指标(Drp1、Fis1、OPA1、Mfn1、Mfn2)、线粒体自噬相关指标(LC3A、LC3B、P62、Parkin、Pink1、VDAC1)和线粒体生物发生相关指标(mt DNA、PGC-1α)等进行检测。

结果表明:(1)体重、肝功能和金属离子检测结果显示,与对照组相比,钼、镉及其联合胁迫下绵羊体重下降且肝指数升高;血清ALT、AST水平升高,而TC、TG、HDLC、LDL-C水平下降;肝脏中Mo、Cd、Cu、Zn含量显著升高,揭示Mo、Cd毒性作用下影响绵羊肝功能及肝脏组织中的金属离子稳态。

(2) 病理组织学结果显示,处理组肝细胞间隙增大,细胞核皱缩,肝窦、肝锁及肝小叶明显扩张,排列紊乱,肝细胞发生空泡变性;透射电镜显示处理组肝脏及肝细胞线粒体嵴断裂、缺失,线粒体肿胀且空泡化严重,线粒体自噬体增多。

(3) 蛋白组学结果显示,钼镉联合胁迫下线粒体共鉴定出360个差异蛋白,其中213个上调蛋白,147个下调蛋白;GO注释和KEGG通路分析,差异蛋白主要与细胞色素P450对外源性物质的代谢、溶酶体、吞噬体等信号传导通路有关,进一步说明钼镉联合诱导了肝线粒体蛋白表达差异,从而造成线粒体损伤。

(4) 钼、镉及其联合导致绵羊肝细胞线粒体抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT活性下降,ROS水平及MDA含量升高;Cs A处理后加重了肝细胞线粒体氧化应激水平,而VBIT处理后缓解了肝细胞线粒体氧化应激水平。

(5) 钼、镉及其联合导致绵羊肝细胞MMP、RCR、OPR水平和ATP含量降低,表明其引起绵羊肝细胞线粒体功能障碍;Cs A处理后加剧了钼镉联合引起的线粒体功能障碍,而VBIT处理后缓解了线粒体功能障碍。

(6) 钼、镉及其联合引起绵羊肝脏和肝细胞Drp1、Fis1 m RNA和蛋白表达水平升高,OPA1、Mfn1、Mfn2 m RNA和OPA1、Mfn2蛋白表达水平降低;mt DNA拷贝数增多,PGC-1αm RNA和蛋白表达下调,表明钼、镉及其联合增加线粒体分裂,减少线粒体融合,破坏线粒体动力学平衡并抑制线粒体生物发生。Cs A处理后加剧了上述结果变化,而VBIT处理则缓解了上述结果变化。

(7)钼、镉及其联合增加了绵羊肝脏LC3B荧光共定位水平、肝细胞线粒体与溶酶体共定位水平;绵羊肝脏和肝细胞LC3A、LC3B、Parkin、Pink1、VDAC1m RNA和LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、Pink1、Parkin、VDAC1蛋白表达水平上调,而P62m RNA和蛋白表达水平下调,表明钼、镉及其联合增加了线粒体自噬水平。Cs A和VBIT处理均能降低线粒体自噬水平。

参考文献

[1]Alterations in hippocampal mitochondrial dynamics are associated with neurodegeneration and recognition memory decline in old male mice.[J].Mishra Ela;Thakur Mahendra Kumar.Biogerontology,2022(prep)

[2]A VDAC1-mediated NEET protein chain transfers[2Fe-2S]clusters between the mitochondria and the cytosol and impacts mitochondrial dynamics[J].Ola Karmi;Henri-Baptiste Marjault;Fang Bai;Susmita Roy;Yang-Sung Sohn;Merav Darash Yahana;Faruck Morcos;Konstantinos Ioannidis;Yaakov Nahmias;Patricia A.Jennings;Ron Mittler;JoséN.Onuchic;Rachel Nechushtai.Proceedings of the National Academy of Sciences,2022(7)

[3]Structure and Gating Behavior of the Human Integral Membrane Protein VDAC1 in a Lipid Bilayer.[J].Najbauer Eszter E;Tekwani Movellan Kumar;Giller Karin;Benz Roland;Becker Stefan;Griesinger Christian;Andreas Loren B.Journal of the American Chemical Society,2022

[4]Sulfotransferase 4A1 activity facilitates sulfate-dependent cellular protection to oxidative stress[J].Brettrager Evan J.;Meehan Arthur W.;Falany Charles N.;van Waardenburg Robert C.A.M..Scientific Reports,2022(1)

[5]柏合.钼镉联合诱导绵羊肝细胞线粒体质量控制失调的作用机制[D].江西农业大学,2022.