RT4的应用

背景^[1-3]

RT4细胞来源于一名63岁的白人男性移行细胞乳头状瘤患者的膀胱组织，细胞显示上皮形态，常用于免疫肿瘤学研究中，也是一种合适的转染宿主。

RT4细胞

RT4细胞培养操作

1) 复苏RT4细胞：

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)RT4细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)RT4细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

RT4可以用于miR-490家族对膀胱癌EJ和RT4细胞生物学行为的影响及机制探讨

以miRNA-490家族为着眼点,旨在研究阐明其在膀胱癌发生进展中的作用及可能的通路,加深miRNA对膀胱癌发生及由非肌层浸润性向肌层浸润性进展机制的认识。这将有助于从分子水平上探索膀胱癌的治疗新靶点,早期、全程的控制膀胱癌病程的进展。[目的]探讨miR-490家族对膀胱癌细胞EJ和RT4生物学行为的影响及其对膀胱癌细胞发生发展的作用,并对其分子机制和信号通路进行深入的研究。

[方法]1.在膀胱癌细胞系EJ和RT4中应用qPCR检测miR-490的基础表达含量;

2. Transwell实验和划痕愈合实验检测miR-490家族对膀胱癌细胞侵袭和迁移能力的影响;

3. CCK8法检测miR-490家族对膀胱癌细胞增殖能力变化的影响;

4. 运用生物信息学的方法预测miR-490家族可能的靶基因;

5. 应用qPCR检测转染后膀胱癌细胞中miR-490家族表达变化以及可能靶基因和相关基因的表达变化;

6. 应用蛋白质免疫印迹实验检测miR-490家族对可能靶基因蛋白和相关蛋白表达的影响。

[结果]1.RT4细胞相较于EJ细胞miR-490的基础表达水平较低;

2. Transwell实验检测细胞侵袭能力的结果为:在EJ和RT4细胞中miR-490-5p模拟物转染组侵袭能力均高于对照组,在RT4细胞中miR-490-3p模拟物转染组侵袭能力高于对照组,miR-490-3p抑制物转染组侵袭能力低于对照组;划痕愈合实验检测细胞迁移能力的结果为:在EJ细胞中miR-490-5p/3p模拟物组细胞划痕面积低于对照组,miR-490-5p/3p抑制物组细胞划痕面积高于对照组;在RT4细胞中miR-490-5p/3p抑制物组划痕面积高于对照组;

3. CCK-8法检测细胞增殖能力的结果为:在EJ和RT4细胞中miR-490-5p/3p模拟物组细胞增殖能力高于对照组,在EJ细胞中miR-490-5p/3p抑制物组细胞增殖能力低于对照组,在RT4细胞中miR-490-3p抑制物组细胞增殖能力低于对照组;

4. TargetScan 7.1数据库和miRDB数据库预测hnRNPA1是miR-490可能的靶基因之一;

5. qPCR检测miR-490及相关基因表达变化结果:在EJ和RT4细胞中,miR-490-5p/3p模拟物组miR-490表达水平均高于对照组,miR-490-5p/3p抑制物组miR-490表达水平均低于对照组;在EJ细胞中,miR-490-5p/3p模拟物组hnRNPA1表达水平高于对照组,而在RT4细胞中,miR-490-5p/3p模拟物组hnRNPA1表达水平低于对照组,miR-490-5p抑制物组hnRNPA1表达水平高于对照组;在EJ和RT4细胞中,miR-490-5p/3p模拟物组Kras表达水平均高于对照组;

6.蛋白质免疫印迹实验检测相关蛋白表达情况结果为:在EJ和RT4细胞中,miR-490-5p/3p模拟物组Kras蛋白表达水平升高,miR-490-5p/3p抑制物组Kras蛋白表达水平降低;在EJ细胞中miR-490-5p/3p抑制物组N-cadherin表达升高,E-cadherin表达降低;在RT4细胞中miR-490-5p/3p模拟物组N-cadherin,E-cadherin表达降低。

参考文献

[1]Pathologic Downstaging and Survival Outcomes Associated with Neoadjuvant Chemotherapy for Variant Histology Muscle Invasive Bladder Cancer..Chakiryan Nicholas H;Jiang Da David;Gillis Kyle A;Green Elizabeth;Hajiran Ali;Hugar Lee;Zemp Logan;Zhang Jingsong;Jain Rohit;Chahoud Jad;Poch Michael;Manley Brandon J;Li Roger;Sexton Wade;Gilbert Scott M.The Journal of urology,2021

[2]UroVysion fluorescence in situ hybridization in urothelial carcinoma:a narrative review and future perspectives..Nagai Takashi;Naiki Taku;Etani Toshiki;Iida Keitaro;Noda Yusuke;Shimizu Nobuhiko;Isobe Teruki;Nozaki Satoshi;Okamura Takehiko;Ando Ryosuke;Kawai Noriyasu;Yasui Takahiro.Translational andrology and urology,2021

[3]Cancer Statistics,2021.Siegel Rebecca L.;Miller Kimberly D.;Fuchs Hannah E.;Jemal Ahmedin.CA:A Cancer Journal for Clinicians,2021

[4]Current and emerging bladder cancer biomarkers with an emphasis on urine biomarkers..Lopez-Beltran Antonio;;Cheng Liang;;Gevaert Thomas;;Blanca Ana;;Cimadamore Alessia;;Santoni Matteo;;Massari Francesco;;Scarpelli Marina;;Raspollini Maria R;;Montironi Rodolfo.Expert review of molecular diagnostics,2020

[5]陈旅阳.miR-490家族对膀胱癌EJ和RT4细胞生物学行为的影响及机制探讨[D].昆明医科大学,2019.