细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒(Membrane and Cytosol Protein Extraction Kit)是一种用于从细胞或组织中提取蛋白质的实验工具。它可以分别提取细胞膜和细胞浆中的蛋白质，以便进一步研究这些蛋白质的功能、结构和相互作用等。

细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒

细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒通常包含以下成分：

1.磷酸缓冲液：用于调节pH值，保证提取过程的稳定性。

2.氯化铵：用于沉淀细胞膜上的蛋白质。

3.乙酸盐：用于改变细胞浆中的pH值，使蛋白质沉淀到溶液底部。

4.硫酸钠：用于稀释样品，提高提取效率。

使用该试剂盒时，需要先将待提取的细胞或组织进行固定、包埋或切片等处理，然后将其加入到预先准备好的试剂盒中，按照说明书上的步骤进行操作。通常情况下，提取后的蛋白质会在不同的离心管中分离出来，需要根据需要进行进一步的纯化和检测。

细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒的操作步骤：

1.将待提取的组织或细胞放入冰浴中，以保持其低温状态。

2.在离心管中加入适量的磷酸缓冲液和氯化铵，使其成为悬浊液。将待提取的组织或细胞悬浮在悬浊液中。

3.将离心管置于高速离心机中，进行离心处理。离心时间通常为5-10分钟，具体时间取决于样品的性质和离心机的型号。离心后，上清液会转移到另一个离心管中。

4.加入适量的乙酸盐和硫酸钠，使悬浊液中的蛋白质沉淀到溶液底部。然后用吸球或移液器将沉淀物转移到一个新的离心管中。

5.在新的离心管中，加入等量的磷酸缓冲液和氯化铵，再次进行离心处理。离心后，上清液会转移到另一个离心管中。重复此步骤2-3次，以获得更纯净的细胞膜蛋白和细胞浆蛋白提取物。

6.最后，可以使用电泳或其他蛋白质分离技术对提取物进行进一步分析和检测。

需要注意的是，在使用该试剂盒时，应根据实验需要选择适当的操作步骤和条件，并严格遵守说明书上的操作要求。同时，应注意避免过度浓缩样品，以免影响蛋白质的质量和纯度。

使用细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒时需要注意以下事项：

1.操作前应仔细阅读说明书，了解试剂盒的使用方法、条件和注意事项。

2.在操作过程中，应注意保持实验环境的清洁和卫生，避免污染样品。

3.在加入试剂时，应注意避免过量或不足。特别是在添加氯化铵和乙酸盐时，应根据样品的性质和离心机的型号进行适当的调整。

4.在离心过程中，应注意控制离心速度和时间，以避免样品过度浓缩或沉淀不完全。

5.在分离蛋白质时，应选择适当的电泳条件和缓冲液，以保证蛋白质的质量和纯度。

6.在处理样品时，应注意避免对细胞或组织造成损伤或破坏。

7.在操作完成后，应及时清洗和消毒实验器材和容器，以避免交叉污染。

应用^[4-5]

细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒可以用于LIPUS联合靶向纳泡促进骨髓间充质干细胞成骨分化的作用及其机制研究

细胞骨架微丝在LIPUS/cRGD-NBs促成骨分化过程中的作用目的:观察LIPUS联合cRGD-NBs作用后细胞骨架微丝的变化以及干扰细胞骨架微丝对于LIPUS/cRGD-NBs促成骨分化能力的影响。

方法:将BMSCs分为四组(Control组,cRGD-NBs组,LIPUS组,LIPUS+cRGD-NBs组),各组处理后0 h、0.5 h、2 h和4 h进行微丝绿色荧光探针染色,于共聚焦显微镜下观察各组微丝形态及荧光强度;通过WB检测胞内纤维状肌动蛋白(Filamentous actin,Factin)与球状肌动蛋白(Globular actin,G-actin)的蛋白表达情况。随后将细胞分为四组:Control组,二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)组,Jasplakinolide(JA)组,细胞松弛素D(Cytochalasin D,Cyto D)组,每组皆进行LIPUS/cRGD-NBs处理。

WB检测各组胞内F-actin与G-actin蛋白表达;ALP染色评估各组早期成骨分化差异以及WB分析成骨相关指标(RUNX2、OPN、OCN)和TRPM7的蛋白表达;免疫荧光染色观察各组RUNX2蛋白表达。结果:与Control组相比,LIPUS处理后2h胞内绿色点状物质明显增多且聚集于核周围,丝状F-actin数量明显减少;4 h后,丝状Factin数量明显增加且荧光强度增强,但胞内仍有少量斑点。而与LIPUS组相比,LIPUS+cRGD-NBs组在各个时间点荧光强度均增强且丝状物质表现更为明显(特别是在4h)。

通过评估各组上述时间点的F-actin/G-actin蛋白表达比值发现,与Control组相比,LIPUS组的比值在0 h无明显变化,0.5 h后下降,2h后降低更为明显,4h后显著升高;而与LIPUS组相比,LIPUS+cRGD-NBs组各个时间点均表现为比值升高(特别是在4h)。细胞骨架干扰药物JA(肌动蛋白聚合剂)或Cyto D(肌动蛋白解聚剂)作用后,与DMSO组相比,Factin/G-actin比值分别表现为显著的上升和下降;JA组ALP阳性染色以及成骨相关指标(RUNX2、OPN、OCN)和TRPM7的蛋白表达均明显增加,而Cyto D组则显著降低,皆与DMSO组相比。

免疫荧光分析各组RUNX2蛋白表达发现与WB呈相同的趋势。结论:LIPUS促BMSCs成骨分化过程中,微丝经历了短暂的解聚和重排后又表现为聚合增加;在LIPUS/cRGD-NBs促成骨分化过程中微丝聚合进一步增强;而促进微丝的聚合能提升LIPUS/cRGD-NBs的促成骨分化能力。

结论:LIPUS/cRGD-NBs促成骨分化过程中TGFβ1表达上调;过表达TGFβ1可能提升LIPUS/cRGD-NBs作用下的成骨分化效应;上调TGFβ1可能协同BMP9诱导的成骨分化效应。

参考文献

[1]Low intensity pulsed ultrasound enhances bone marrow-derived stem cells-based periodontal regenerative therapies.Wang Yunji;Li Jie;Zhou Jianpin;Qiu Ye;Song Jinlin.Ultrasonics,2022

[2]Low Intensity Pulsed Ultrasound for Bone Tissue Engineering.McCarthy Colleen;CamciUnal Gulden.Micromachines,2021

[3]Theranostic nanobubbles towards smart nanomedicines.Zahiri Mahsa;Taghavi Sahar;Abnous Khalil;Taghdisi Seyed Mohammad;Ramezani Mohammad;Alibolandi Mona.Journal of Controlled Release,2021

[4]Piezoelectric Microvibration Mitigates Estrogen Loss-Induced Osteoporosis and Promotes Piezo1,MicroRNA-29a,and Wnt3a Signaling in Osteoblasts.Wu ReWen;Lian WeiShiung;Chen YuShan;Ko JihYang;Wang ShaoYu;Jahr Holger;Wang FengSheng.International Journal of Molecular Sciences,2021

[5]姚欢.LIPUS联合靶向纳泡促进骨髓间充质干细胞成骨分化的作用及其机制研究[D].重庆医科大学,2022.