大鼠胰腺外分泌腺肿瘤细胞的应用

背景^[1-3]

大鼠胰腺外分泌腺肿瘤细胞也称为AR42J。，该细胞源自大鼠胰外分泌性腺肿瘤，由N.W.Jessop于1980年建系。大鼠胰腺外分泌腺肿瘤细胞在肾上腺皮质激素刺激下可诱导出外分泌活性，并伴有广泛的内质网重构。

大鼠胰腺外分泌腺肿瘤细胞

大鼠胰腺外分泌腺肿瘤细胞的培养

大鼠胰腺外分泌腺肿瘤细胞培养基及培养冻存条件准备：

1）准备F-12K培养基；优质胎牛血清，20%；双抗，1%。

2）大鼠胰腺外分泌腺肿瘤细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）大鼠胰腺外分泌腺肿瘤细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

三、大鼠胰腺外分泌腺肿瘤细胞处理：

1）冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）大鼠胰腺外分泌腺肿瘤细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）大鼠胰腺外分泌腺肿瘤细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

应用^[4][5]

大鼠胰腺外分泌腺肿瘤细胞可以用于miR-15b-5p对大鼠的胰腺外分泌细胞AR42J凋亡的影响

急性胰腺炎(Acute pancreatitis,AP)是一种伴有胰脏腺泡细胞损伤凋亡、胰脏炎症及强烈的全身炎症反应的胃肠疾病。细胞凋亡的调节在整个生物体生长发育及疾病发展方面起着重要作用。mi R-15b-5p在多种疾病中有着调控细胞凋亡继而影响疾病发展的作用。而mi R-15b-5p在急性胰腺炎细胞凋亡中的作用尚未被研究,因此本文旨在探究mi R-15b-5p是否参与对急性胰腺炎细胞凋亡的调控。

方法：在体外将AR42J细胞培养至对数生长期,加入浓度100n M的雨蛙素进行AP造模,造模完成后提取mi RNA进行采用q RT-PCR检测mi R-15b-5p相对表达量。随后利用转染试剂将mi R-15b-5p mimics、mi R-15b-5p mimics NC、mi R-15b-5p inhibitor、mi R-15b-5p inhibitor NC转染进AR42J细胞中,转染24小时后提取mi RNA采用q RT-PCR检测mi R-15b-5p的相对表达量。

接着将处于对数生长期的细胞种于六孔板中,按照上述分组对细胞进行转染,24小时后,每孔细胞中加入雨蛙素处理24小时构建体外急性胰腺炎模型,采用q RT-PCR检测mi R-15b-5p的相对表达量,同时采用q RT-PCR检测Caspase-3及Caspase-9的m RNA相对表达水平,提取细胞蛋白采用Western blot测定Caspase-3及Caspase-9蛋白相对表达水平,采用流式细胞术来测定各组细胞的凋亡状况。

结果(1)在AP模型中,q RT-PCR结果显示AP组mi R-15b-5p相对表达量较空白对照组增加(P<0.05)。

(2) 转染后mi R-15b-5p在mi R-15b-5p mimics组相对表达水平增高(P<0.05),在mi R-15b-5p inhibitor组中相对表达水平降低(P<0.05),说明转染成功。

(3) 使用mi R-15b-5p inhibitor后,细胞凋亡有关基因Caspase-3和Caspase-9的m RNA相对表达水平下降(P<0.05),而在使用mimics之后,m RNA相对表达水平提高(P<0.05)。

(4) Western blot测定表明使用mi R-15b-5p inhibitor后,细胞凋亡有关基因Caspase-3和Caspase-9的蛋白质相对表达水平下降(P<0.05),而在使用mimics以后,蛋白质的相对表达水平上升(P<0.05)。

(5) 流式细胞术测定提示使用mi R-15b-5p inhibitor后,细胞凋发生率下降(P<0.05),而在使用mimics以后,细胞凋亡发生率上升(P<0.05)。

结论：发生胰腺炎时,mi R-15b-5p表达量相对增高,mi R-15b-5p inhibitor能够减少由雨蛙素所诱发的胰腺外分泌细胞凋亡,而在使用mi R-15b-5p mimics以后,增加了细胞凋亡。mi R-15b-5p可能通过活化Caspase-9激活下游Caspase-3,诱发细胞凋亡。故mi R-15b-5p可能是防治急性胰腺炎有效的潜在靶点。

参考文献

[1]MiR-15p-5p Mediates the Coordination of ICAM-1 and FAK to Promote Endothelial Cell Proliferation and Migration..Gu Wei;Zhang Li;Zhang Xinhua;Wang Binyu;Shi Xiaoyu;Hu Kang;Ye Yingying;Liu Guoquan.Inflammation,2022

[2]Shikonin inhibits neuronal apoptosis via regulating endoplasmic reticulum stress in the rat model of double-level chronic cervical cord compression..Yao Min;Li Gan;Zhou LongYun;Zheng Zhong;Sun YueLi;Liu ShuFen;Wang YongJun;Cui XueJun.Cell biology and toxicology,2022

[3]VDAC2 and the BCL-2 family of proteins..Yuan Zheng;Dewson Grant;Czabotar Peter E;Birkinshaw Richard W.Biochemical Society transactions,2021

[4]MicroRNA Sequencing Analysis in Obstructive Sleep Apnea and Depression:Anti-Oxidant and MAOA-Inhibiting Effects of miR-15b-5p and miR-92b-3p through Targeting PTGS1-NF-κB-SP1 Signaling.Chen YungChe;Hsu PoYuan;Su MaoChang;Chen TingWen;Hsiao ChangChun;Chin ChienHung;Liou ChiaWei;Wang PoWen;Wang TingYa;Lin YongYong;Lee ChiuPing;Lin MengChih.Antioxidants,2021

[5]王福贵.miR-15b-5p对大鼠的胰腺外分泌细胞AR42J凋亡的影响[D].安徽医科大学,2023.