小鼠巨噬细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠巨噬细胞良好地保持了小鼠巨噬细胞的特性。该细胞在LPS引起的全身炎症反应综合征的研究中起到了重要作用；另外小鼠巨噬细胞在与特殊物质（如草酸钙）之间的相互作用以及在小鼠免疫调节中的相关探索也是现在科学研究的热点。

小鼠巨噬细胞

小鼠巨噬细胞操作步骤：

注意：收到的小鼠巨噬细胞如24 h内复苏，可存放于-80℃冰箱；超过24 h请存放于液氮中，复苏前10 min取出，放于-80℃，让管中液氮挥发。

1.水浴锅37℃预热。

2.完全培养基温浴到37℃。

3.在15 mL离心管中加入5 mL以上完全培养基备用。

4.从-80℃冰箱中取出细胞，放入37℃水浴锅中，快速晃动，使冻存液迅速融化。

注意:1）融化过程必须晃动冻存管，保证冻存液融化迅速、均匀；

2）晃动时应避免水没过管盖造成污染；

3）管内冻存液融化至只剩一个约2 mm直径的冰晶时，即停止水浴。继续晃动冻存管，至冰晶融化。

5.用75%医用酒精擦拭冻存管外表面。

6.在超净台中打开冻存管，用巴氏吸管或移液枪吸取细胞冻存悬液，转移至先前准备的离心管中。

7.用1 mL完全培养基洗涤冻存管1次，收集残留细胞，减少损失。

8.小鼠巨噬细胞悬液以140×g离心5 min。

注意：请以公式a=ω2r（a:向心加速度；ω:旋转角速度，ω=πn/30；r:转子半径）计算相应转速。

9.离心后去除上清。加入2 mL完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀。

10.将小鼠巨噬细胞接种到1个T25培养瓶或底面积相当的培养容器中。加入足量完全培养基，1个T25培瓶中培养基总量不少于5 mL。

11.摇匀细胞，放入37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中。

12.复苏次日，观察细胞状态，并更换新鲜的完全培养基或传代。

13.之后，每3天更换一次完全培养基，直到小鼠巨噬细胞汇合度至合适密度。

应用^[4-5]

小鼠巨噬细胞可以用于小鼠巨噬细胞ANA-1的诱导分化及其不同分型在叶酸性肾病中的作用

实验使用不同方法刺激小鼠巨噬细胞ANA-1诱导出不同表型巨噬细胞，比较不同条件刺激下各表型巨噬细胞表达蛋白及分泌因子的差异，建立起ANA-1的表型分化体系，同时研究B7-H3对ANA-1表型的影响，为B7-H3的临床应用提供理论依据。此外，应用脂多糖（LPS）或IL-4分别刺激的ANA-1输入到小鼠体内，观察不同条件刺激下的小鼠巨噬细胞对小鼠肾小管间质纤维化的影响。

方法:1.在1640和FBS培养ANA-1巨噬细胞的过程中，分别加用LPS、IL-4、B7-H3单克隆抗体（简称B7-H3mAb）、B7-H3mAb+LPS、B7-H3mAb+IL-4，同时设立空白对照组、小鼠IgG对照组，培养24小时后收取细胞及上清液，流式细胞术检测诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)、巨噬细胞甘露糖受体（CD206）的蛋白表达水平，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞上清液IL-10、TNF-α的表达。

2. 采用两次腹腔注射叶酸的方法建立肾小管间质纤维化模型，CD1小鼠随机分为正常对照组、叶酸组、LPS+叶酸组、IL-4+叶酸组，分别于第14天和21天处死小鼠，留取血标本测肌酐（Cr）、尿素(UN)、尿酸(UA)水平，摘取右肾行常规HE染色、MASSON染色及F4/80巨噬细胞、ɑ平滑肌肌动蛋白（ɑ-SMA）、胶原蛋白I（COLI）免疫组织化学染色。

结果：部分：

1.小鼠巨噬细胞ANA-1经LPS刺激24h后B7-H3的表达升高，而IL-4刺激24h后的B7-H3的表达降低，差异均有统计学意义（P<0.05）；

2.与空白对照组相比，LPS组高表达iNOS，加入B7-H3mAb后iNOS的表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；

3.CD206在各组均高表达；

4.与空白对照组相比，IL-4组及IL-4+B7-H3mAb组产生的IL-10明显增加（P<0.05），LPS组、B7-H3mAb组和LPS+B7-H3mAb组则无明显差别；TNF-α的水平与空白对照组相比IL-4+B7-H3mAb组虽有统计学意义，但变化不大，其他五组与空白对照组相比无明显差异。

第二部分：

1. HE染色和Masson染色显示正常对照组肾脏正常，叶酸组、LPS+叶酸组、IL-4+叶酸组小鼠UN、Cr、UA明显升高，肾小管间质纤维化，肾损伤严重程度LPS+叶酸组最重，叶酸组次之，IL-4+叶酸组最轻。

2. 免疫组织化学结果：两周时叶酸组、LPS+叶酸组、IL-4+叶酸组可见F4/80+巨噬细胞浸润，ɑ-SMA和COLI的表达量均明显高于正常对照组（P<0.05），模型组间无明显差别；三周时，ɑ-SMA的表达在IL-4+叶酸组明显低于LPS+叶酸组和叶酸组(P<0.05)，COLI的表达，LPS+叶酸组最高，叶酸组次之，IL-4+叶酸组最低，差异有统计学意义（P<0.05）。

结论：部分：1.1μg/mlLPS刺激小鼠巨噬细胞ANA-1上调iNOS的水平，向M1型巨噬细胞极化并上调B7-H3的表达，B7-H3mAb下调LPS活化的ANA-1iNOS的表达。

2.10ng/mlIL-4刺激小鼠巨噬细胞ANA-1下调B7-H3的表达，并促进IL-10的分泌，向M2型巨噬细胞极化。

第二部分：1.两次240mg/kg叶酸腹腔注射后，叶酸组小鼠肾脏肾小管间质明显纤维化，免疫组织化学示肾间质F4/80+巨噬细胞数量、COLⅠ及ɑ-SMA明显增加，该方法成功建立肾小管间质纤维化模型。

2.LPS和IL-4分别诱导的巨噬细胞输入到叶酸性肾病小鼠体内，LPS刺激的巨噬细胞明显加重叶酸性肾病小鼠肾小管间质的损伤，具体表现为肾小管间质COLⅠ的产生和小管间质纤维化的面积明显增加；而IL-4活化的M2型巨噬细胞抑制叶酸性肾病小鼠肾小管间质纤维化，具体表现在肾小管间质COLⅠ及ɑ-SMA的产生以及小管间质纤维化的面积明显减少。

参考文献

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[5]李迪.小鼠巨噬细胞ANA-1的诱导分化及其不同分型在叶酸性肾病中的作用[D].苏州大学,2013.