放线共生放线杆菌PCR试剂盒的应用

背景^[1-3]

放线共生放线杆菌PCR试剂盒是一种用于检测放线共生放线杆菌的分子生物学试剂。该试剂盒通常包含用于扩增特定DNA片段的引物、DNA聚合酶以及其他的必需试剂，能够在PCR仪中运行，对特定的DNA序列进行快速、灵敏的检测。

放线共生放线杆菌

放线共生放线杆菌PCR试剂盒实验操作

1.放线共生放线杆菌PCR试剂盒模板制备（样本制备区）

建议使用配套水生动物病害基因组DNA/RNA提取试剂盒系列产品，具体过程详见产品说明书。

2．添加模板（模板添加区，放置于冰盒中进行）

请于-20℃条件下保存，有效期12个月

取出所需测试数的已含有反应液A-TSV-I的PCR管，将试剂完全解冻，离心30秒，在管盖上标记管名（阴性对照管NG、样品XX、阳性对照管PG）。打开管盖向各管管底分别加入0.8μL B-I及0.2μL R-I，盖上阴性对照管管盖，其他各管分别沿管壁加入2μL模板，顺序为待测样品模板、PG-TSV-I，依次盖好各管管盖，离心30秒，立即进行扩增反应。

3.放线共生放线杆菌PCR试剂盒扩增反应（扩增及产物分析区）

①恒温仪器63℃条件下反应60 min。待仪器升温至63℃后，新建程序，设置实验名称及反应时间，将步骤2中离心后的PCR反应管放入恒温荧光分子检测仪，点击开始检测。

②若使用荧光定量PCR仪，则荧光基团选择FAM，淬灭基团选择None，将63℃15 s，63℃45 s作为一个循环，于63℃45 s处收集荧光信号，60个循环。

其他仪器请参照仪器说明书进行设置。

4.设置qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）

如果只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于PCR阳性对照。如果做2-3次重复，则反应设置数量相应增加2或3倍。

5.数据处理

如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。

应用^[4-5]

放线共生放线杆菌PCR试剂盒可以用于牙周病原菌在牙周病人龈下菌斑中的分布研究

牙周病原菌在牙周病人银下菌斑中的分布研究目的应用聚合酶链式反应分别检测牙周病人酿下菌斑中的10种牙周病原菌，观察其分布特点，并初步分析不同的细菌组合与牙周病的关系。

材料与方法:使用放线共生放线杆菌PCR试剂盒将聚合酶链式反应扩增出牙酿叶琳菌部分165 rRNA基因片段的实验方法推广致更多的牙周病病原菌。根据各自特异区的165 rRNA基因(165 rDNA)序列，分别合成10种牙周病病原菌:牙跟叶琳菌(Pg)，福塞类杆菌(Bf)，中间型普里沃菌(Pi)，齿垢密螺旋体(Td)，变黑普里沃菌(Pn)，直型弯曲杆菌(Cr)，溶蚀艾肯菌(Ec)，放线共生放线杆菌(Aa)，黄褐二氧化碳噬纤维菌(C。)，生痰二氧化碳噬纤维菌(CS)的特异引物，然后随机选择62位患者，其中牙周健康者16例，慢性边缘性牙跟炎患者17例，慢性牙周炎患者29例，每例选两个位点，分别取两份跟下菌斑标本，共124份样本。

同时记录各病例的一般情况:年龄，性别，吸烟情况和各项临床指标:探查袋深，探诊出血情况等，牙周炎患者同时记录附着水平。提取菌斑中的DNA，分别用10对特异引物，TaqDNA聚合酶等以及放线共生放线杆菌PCR试剂盒在适宜的条件和温度下进行聚合酶链式反应，反应产物在加入0.sug/m1澳化已锭(EB)的1.50rk琼脂糖凝胶中电泳，紫外透射仪下进行观察，采用DLZ000 DNA marker记录电泳DNA片段大小，检测是否出现与特异引物相对应的特异扩增带，以鉴定细菌种类。用统计软件分析细菌与病例一般情况与各项临床指标的关系。

结果:10种牙军医进修学院硕士学位论文周病病原菌在各组中都有检出，其中跟炎组牙跟叶琳菌(Pg)，中间型普里沃菌(pi)和齿垢密螺旋体(Td)的检出率高于健康组;牙周病组牙龋叶琳菌(Pg)，福塞类杆菌(Bf)，中间型普里沃菌(Pi)，齿垢密螺旋体(Td)，变黑普里沃菌(Pn)和黄褐二氧化碳噬纤维菌(Co)的检出率高于健康组;牙周病组的中间型普里沃菌(Pi)，齿垢密螺旋体(Td)和变黑普里沃菌(Pn)高于龋炎组。

随年龄增大，齿垢密螺旋体(Td)的检出率增加;女性龋下菌斑中的牙跟叶琳菌(Pg)检出率多于男性;不吸烟者患者中检出较多的牙龋叶琳菌(Pg)。中间型普里沃菌(Pi)、齿垢密螺旋体(Td)和变黑普里沃菌(Pn)与牙周病关系更为密切。

参考文献

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