白乐杰马杜拉放线菌PCR试剂盒的应用

背景^[1-3]

白乐杰马杜拉放线菌PCR试剂盒是一种专门用于检测白乐杰马杜拉放线菌的生物试剂，采用荧光定量PCR技术，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。

白乐杰马杜拉放线菌PCR试剂盒的引物经过精心优化，专一性强，只扩增巴斯德氏杆菌属，与其他微生物没有交叉反应。试剂盒通常包括PCR反应液、酶、引物等成分，以及使用手册和相关应用指南。

白乐杰马杜拉放线菌PCR试剂盒适用于对感染疾病的诊断，理论上只要样本有一个病原体存在，PCR就可以检测到。这种试剂盒在临床诊断、流行病学调查和生物安全领域具有重要的应用价值。

白乐杰马杜拉放线菌PCR试剂盒

白乐杰马杜拉放线菌PCR试剂盒实验操作

1.模板制备（样本制备区）建议使用配套水生动物病害基因组DNA/RNA提取试剂盒系列产品，具体过程详见产品说明书。2．添加模板（模板添加区，放置于冰盒中进行）请于-20℃条件下保存，有效期12个月取出所需测试数的已含有反应液A-TSV-I的PCR管，将试剂完全解冻，离心30秒，在管盖上标记管名（阴性对照管NG、样品XX、阳性对照管PG）。打开管盖向各管管底分别加入0.8μL B-I及0.2μL R-I，盖上阴性对照管管盖，其他各管分别沿管壁加入2μL模板，顺序为待测样品模板、PG-TSV-I，依次盖好各管管盖，离心30秒，立即进行扩增反应。3.扩增反应（扩增及产物分析区）①恒温仪器63℃条件下反应60 min。待仪器升温至63℃后，新建程序，设置实验名称及反应时间，将步骤2中离心后的PCR反应管放入恒温荧光分子检测仪，点击开始检测。②若使用荧光定量PCR仪，则荧光基团选择FAM，淬灭基团选择None，将63℃15 s，63℃45 s作为一个循环，于63℃45 s处收集荧光信号，60个循环。其他仪器请参照仪器说明书进行设置。设置qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）10.如果只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于PCR阳性对照。如果做2-3次重复，则反应设置数量相应增加2或3倍。11.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后加）。

应用^[4-5]

白乐杰马杜拉放线菌PCR试剂盒可以用于尤马马杜拉放线菌产素不稳定性研究及高产菌株选育

对尤马马杜拉放线菌的产素不稳定性进行研究，同时进行马杜霉素高产菌株的选育和发酵工艺的改良。

由尤马马杜拉放线菌S-1菌株经平板划线和白乐杰马杜拉放线菌PCR试剂盒分离获得突变株FS-11、FS-12、FS-13、FS-18、FS-19和SS-1，并且对它们的生活周期和菌落生长特征进行了观察，S-1菌株具有典型的尤马马杜拉放线菌分化过程；确定了各突变株在形态上的差异和分化阻断发生的时期；通过摇瓶发酵实验，掌握了各菌株的发酵基本特性和产马杜霉素的能力，发现FS-11、FS-12为高产突变菌株，而FS-18、FS-19为完全丧失产素能力的突变株；对S-1、FS-11、FS-13、FS-19、SS-1各菌株的抗生素抗性进行测定发现，尤马马杜拉放线菌对氯霉素和红霉素较为敏感，而对青霉素和马杜霉素有明显抗性，对链霉素也有抗性，产素能力越高的突变菌株对链霉素的抗性越强，结果表明尤马马杜拉放线菌各突变株产素能力与其对链霉素抗性呈正相关；对各菌株的抑菌活性进行检测，发现各产马杜霉素菌株对G+菌有很强的抑菌活性，而对不产马杜霉素的突变株无任何抗菌活性，说明其没有新的抗菌物质产生；对不产马杜霉素的FS-19菌株的产抗能力的恢复性实验，结果表明无法通过实验恢复其产素能力；通过以上这些实验初步了解了与尤马马杜拉放线菌产素不稳定性相关的特征，但尚未搞清其产素不稳定性的直接原因。

出发菌株尤马马杜拉放线菌S-1，经过链霉素抗性及白乐杰马杜拉放线菌PCR试剂盒筛选，挑取223个菌株，经过初筛和复筛得到7株菌株马杜霉素的产量高于出发菌株，其中3个菌株S1-007、S1-123和S1-018的产素量与出发菌株的6236 ug／ml相比有较大提高，分别为8020ug／ml，8254 ug／ml和9175 ug/ml，尤其是突变菌株S1-018的产量比出发菌株高47％。经5次传代，筛选所得的三个菌株保持了较好的高产稳定性。经5L，20L和80L发酵罐发酵实验，在确定不改变初始糖浓度的情况下，通过补糖保持发酵液中糖浓度不低于1％，结合发酵后期补糖方案，可比常规发酵的产量提高近40％。

参考文献

[1]Mutational analysis of the Streptomyces lividans recA gene suggests that only mutants with residual activity remain viable.G.Muth;;D.Frese;;A.Kleber;;W.Wohlleben.MGG-Molecular&General Genetics,1997

[2]Chromosomal deletions in Streptomyces griseus that remove the afsA locus.A.Lezhava;;D.Kameoka;;H.Sugino;;K.Goshi;;H.Shinkawa;;O.Nimi;;S.Horinouchi;;T.Beppu;;H.Kinashi.MGG-Molecular&General Genetics,1997

[3]Genetic instability in Streptomyces.K.Dharmalingam;;J.Cullum.Journal of Biosciences,1996

[4]DNA amplifications and deletions in Streptomyces lividans 66 and the loss of one end of the linear chromosome.Uwe Rauland;;Ingrun Glocker;;Matthias Redenbach;;John Cullum.Mgg Molecular&General Genetics,1995

[5]朱辉.尤马马杜拉放线菌产素不稳定性研究及高产菌株选育[D].华中农业大学,2003.