J774A.1 小鼠单核巨噬细胞的应用

背景^[1-3]

J774A.1小鼠单核巨噬细胞是一种小鼠单核巨噬细胞系，常被用于研究炎症、感染和免疫等方面的实验。这些细胞具有吞噬和杀伤细菌、病毒和其他微生物的能力，同时也可以分泌多种细胞因子和炎症介质，参与免疫应答和炎症反应。

在研究中，J774A.1细胞系经常被用于评估药物对炎症和感染的治疗效果，以及探讨免疫细胞的活化和功能机制。此外，这种细胞系也常被用于研究脂多糖（LPS）等细菌成分对炎症和免疫反应的影响。

J774A.1小鼠单核巨噬细胞

J774A.1小鼠单核巨噬细胞培养操作

1)复苏J774A.1小鼠单核巨噬细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)J774A.1小鼠单核巨噬细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)J774A.1小鼠单核巨噬细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

J774A.1小鼠单核巨噬细胞可以用于无机砷对小鼠J774A.1单核巨噬细胞功能的影响及TFEB介导的自噬在其中的可能调控作用

选取亚砷酸钠作为暴露因素,首先观察无机砷暴露对J774A.1单核巨噬细胞的吞噬功能、粘附性、以及核转录因子TFEB和自噬-溶酶体途径相关蛋白LC3、p62、LAMP 1、CTSB、CTSL等的可能影响;进而,通过建立TFEB低表达的tfeb-sgRNA J774A.1单核巨噬细胞稳转模型,深入探讨TFEB介导的自噬在无机砷影响巨噬细胞功能中的可能调控作用。

研究方法:1、J774A.1单核巨噬细胞的培养和分组:小鼠J774A.1单核巨噬细胞常规培养传代。分组和染毒情况具体如下:tfeb-sgRNA转染前:中性红染色实验为As3+(0.5、1、2μM)处理巨噬细胞12、24和36 h。其余实验均为As3+(0.5、1、2μM)处理巨噬细胞24 h。分组为con组、0.5μM NaAsO2组、1μM NaAsO2组和2μM NaAsO2组。tfeb-sgRNA转染后:所有实验均为1μM As3+处理巨噬细胞24 h。分组为NC-sgRNA组、tfeb-sgRNA-1组、tfeb-sgRNA-2组以及tfeb-sgRNA-3组。

2、细胞吞噬功能检测:中性红染色法。

3、细胞粘附性检测:结晶紫染色法。

4、Western blot蛋白免疫印迹检测:提取细胞全蛋白,按照试剂盒说明书进行蛋白质浓度测定;蛋白变性后,上样、电泳、转模、封闭以及孵育一抗和二抗,分别检测TFEB、LC3、p62、CTSB、CTSB、LAMP 1和β-actin的蛋白表达。

5、慢病毒转染和稳转细胞系建立:根据预实验MOI值以及最适嘌呤霉素剂量,将状态良好的小鼠J774A.1单核巨噬细胞转染NC-sgRNA、tfeb-sgRNA-1、tfeb-sgRNA-2、tfeb-sgRNA-3病毒及相应促转染剂;24h后观察细胞状态正常,更换普通培养基,待稳定后添加浓度为2μg/ml Puromycin,继续培养并进行传代、冻存。

6、细胞活力检测:CCK-8法。

7、统计学分析:应用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析,各组间差异的比较运用单因素方差分析(ANOVA)。P<0.05为差异具有统计学意义。

结果:1、无机砷对J774A.1 小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响本实验用0.5、1以及2μM无机砷分别处理巨噬细胞12 h、24 h和36 h,通过中性红染色法检测巨噬细胞的吞噬能力。结果表明在无机砷处理12 h后,与con组相比,仅有2μM剂量组对细胞吞噬功能有明显抑制(P<0.05)。不同浓度无机砷处理24 h后,与con组相比,1μM和2μM剂量组细胞吞噬率出现抑制作用(P<0.05)。在无机砷处理巨噬细胞36 h后,与con组相比,各剂量无机砷均会抑制细胞的吞噬功能(P<0.05)。

2、无机砷对J774A.1 小鼠单核巨噬细胞粘附性的影响在0.5、1和2μM无机砷分别处理细胞24 h后,用结晶紫染色法检测了巨噬细胞的粘附性。实验结果表明,与con组相比,1μM和2μM的无机砷处理会抑制巨噬细胞的粘附性,具有统计学差异(P<0.05)。

3、无机砷对J774A.1 小鼠单核巨噬细胞自噬溶酶体途径的影响本实验用0.5、1和2μM无机砷处理巨噬细胞24 h后收集全蛋白。Western blot检测结果显示,与con组相比,无机砷处理使TFEB蛋白表达升高(P<0.05);与con组相比,各剂量组LC3-Ⅱ蛋白水平升高,且在无机砷浓度为1μM和2μM时,LC3Ⅱ蛋白表达升高明显(P<0.05);与con组相比,无机砷处理组p62蛋白表达均升高(P<0.05);与con组相比,2μM无机砷处理的LAMP 1的蛋白表达水平升高(P<0.05);与con组相比,无机砷使溶酶体组织蛋白酶CTSB和CTSL的蛋白表达升高,其中1μM和2μM剂量组蛋白表达升高明显(P<0.05)

参考文献

[1]Arsenite-induced cytotoxicity is regulated by p38-SQSTM1/p62 and JNK-BNIP3L/Nix signaling in lung cancer cells.Lee Hyun-Young;Oh Seon-Hee.Biochemical and Biophysical Research Communications,2022

[2]TFEB Promotes Prostate Cancer Progression via Regulating ABCA2-Dependent Lysosomal Biogenesis.Zhu Xuejin;Zhuo Yangjia;Wu Shulin;Chen Yanfei;Ye Jianheng;Deng Yulin;Feng Yuanfa;Liu Ren;Cai Shanghua;Zou Zhihao;Wang Bin;Wu Chin Lee;Zeng Guohua;Zhong Weide.Frontiers in Oncology,2021

[3]Arsenic trioxide induces macrophage autophagy and atheroprotection by regulating ROS-dependent TFEB nuclear translocation and AKT/mTOR pathway.Fang Shaohong;Wan Xin;Zou Xiaoyi;Sun Song;Hao Xinran;Liang Chenchen;Zhang Zhenming;Zhang Fangni;Sun Bo;Li Hulun;Yu Bo.Cell Death&Disease,2021

[4]Liraglutide Alleviates Hepatic Steatosis by Activating the TFEB-Regulated Autophagy-Lysosomal Pathway.Fang Yunyun;Ji Linlin;Zhu Chaoyu;Xiao Yuanyuan;Zhang Jingjing;Lu Junxi;Yin Jun;Wei Li.Frontiers in Cell and Developmental Biology,2020

[5]李婷.无机砷对小鼠J774A.1单核巨噬细胞功能的影响及TFEB介导的自噬在其中的可能调控作用[D].中国医科大学,2023.