大鼠下丘脑神经元细胞的应用

背景^[1-3]

大鼠下丘脑神经元细胞是一种原代细胞，来源于脑组织，通常用于科研实验。这种细胞具有特定的生理功能，如合成和分泌神经递质等。

大鼠下丘脑神经元细胞是一种神经元，位于下丘脑的神经元网络中。它们与其他神经元一起构成了下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)，该轴对身体的应激反应和代谢调节起着重要作用。

大鼠下丘脑神经元细胞通常具有长而细的轴突，这些轴突延伸到垂体前叶并释放促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)。CRH刺激垂体前叶分泌促肾上腺皮质激素(ACTH)，进而刺激肾上腺皮质分泌皮质醇等激素。这些激素可以调节身体的应激反应、免疫系统和代谢功能。

除了HPA轴外，大鼠下丘脑神经元细胞还与其他神经元相互作用，参与调节食欲、性行为、体温和睡眠等生理过程。例如，它们可以与下丘脑内的食欲调节中枢相互作用，控制食欲和能量代谢；也可以与下丘脑内的性行为中枢相互作用，调节性行为和生殖功能。

在科研实验中，大鼠下丘脑神经元细胞常被用于研究神经系统的基本生理过程，如神经信号的传递、神经细胞的电活动等。此外，这种细胞也常被用于药物筛选和毒性测试等领域。

在培养大鼠下丘脑神经元细胞时，需要提供适宜的培养条件，如适宜的温度、湿度和营养物质等。同时，还需要注意细胞的生长状态和物种来源等信息，以确保细胞的健康和稳定性。

大鼠下丘脑神经元细胞

大鼠下丘脑神经元细胞培养操作

1)复苏大鼠下丘脑神经元细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)大鼠下丘脑神经元细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)大鼠下丘脑神经元细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

大鼠下丘脑神经元细胞可以用于调更汤调控ASK1/MKK7/JNK信号通路改善下丘脑神经元细胞凋亡的作用机制研究

基于前期研究发现“调更汤”能够改善下丘脑氧化损伤、延缓下丘脑神经组织衰老的结果,本实验通过动物实验及细胞实验研究“调更汤”改善大鼠下丘脑神经元细胞凋亡发挥中枢神经保护作用,及其调控ASK1/MKK7/JNK信号通路发挥抗凋亡作用的分子机制,阐释“调更汤”治疗绝经综合征的可能机理,为推广“调更汤”的临床应用提供科学依据。

方法：动物实验:120只SPF级4月龄雌性SD大鼠,分为假手术组(Sham)、去势手术组(OVX)、戊酸雌二醇组(OVX+Ev)、调更汤低剂量组(OVX+TG 9.69g)、调更汤中剂量组(OVX+TG 19.37g)及调更汤高剂量组(OVX+TG 38.74g)六个组。适应性饲养一周后,一组行假手术,另外五组切除双侧卵巢。造模成功后,Sham组及OVX组给予生理盐水灌胃,OVX+Ev组给予戊酸雌二醇(0.12 mg/kg)灌胃,调更汤低、中、高剂量组分别给予三种不同剂量的中药调更汤灌胃。治疗4周后,运用Nissl染色法观察大鼠下丘脑神经元细胞病理形态学改变;运用透射电子显微镜观察下丘脑神经细胞的超微结构改变;运用TUNEL染色法检测下丘脑神经细胞凋亡率;运用q RT-PCR技术和Western blot技术检测Bcl-2家族基因及蛋白变化情况;运用Western blot技术检测ASK1/MKK7/JNK通路相关蛋白ASK1、MKK7、JNK、c-Jun、Casp3及其磷酸化的表达。

细胞实验:将大鼠下丘脑神经元细胞传代2-3代。

取处于生长对数期的大鼠下丘脑神经元细胞随机2万细胞每孔铺板96孔板,CCK-8法筛选调更汤干预GT1-7细胞的浓度;取处于生长对数期的GT1-7细胞随机分为对照组(Con),模型组(TBTC),17β-E2组(17β-E2),调更汤低剂量组(TG 31.25μg/m L),调更汤中剂量组(TG 62.5μg/m L)及调更汤高剂量组(TG 125μg/m L)。CCK8法检测TBTC作用于GT1-7细胞活力实验;光镜下观察细胞形态;Hoechst33258染色法观察凋亡细胞核形态;Annexin V-FITC/PI双染色流式技术检测GT1-7细胞凋亡水平;TMT磷酸化修饰定量蛋白组学经生信分析相关通路及差异蛋白;应用q RT-PCR技术、Western blot技术检测Bcl-2、Bax基因及蛋白变化情况;运用Western blot技术检测ASK1/MKK7/JNK通路相关的蛋白ASK1、MKK7、JNK、c-Jun、Casp3及其磷酸化的表达。

参考文献

[1]A subpopulation of Bdnf-e1–expressing glutamatergic neurons in the lateral hypothalamus critical for thermogenesis control[J].He You;;Pengcheng Chu;;Wei Guo;;Bai Lu.Molecular Metabolism,2020

[2]Hormone therapy for first-line management of menopausal symptoms:Practical recommendations[J].Santiago Palacios;;John C Stevenson;;Katrin Schaudig;;Monika Lukasiewicz;;Alessandra Graziottin.Women’s Health,2019

[3]Caspases in Cell Death,Inflammation,and Disease[J].Nina Van Opdenbosch;;Mohamed Lamkanfi.Immunity,2019

[4]ERK activation by zeranol has neuroprotective effect in cerebral ischemia reperfusion[J].Shimaa K.Mohamed;;Amany A.E.Ahmed;;Engy M.Elmorsy;;Shahira Nofal.Life Sciences,2019

[5]李盛楠.调更汤调控ASK1/MKK7/JNK信号通路改善下丘脑神经元细胞凋亡的作用机制研究[D].上海中医药大学,2023.