大鼠膀胱平滑肌细胞的应用

背景^[1-3]

大鼠膀胱平滑肌细胞是构成大鼠膀胱壁的主要细胞类型之一。这些细胞属于平滑肌细胞家族，具有收缩和舒张的能力，从而控制尿液在膀胱中的储存和排放。

在生物医学研究中，大鼠膀胱平滑肌细胞被广泛用于模拟和研究人体膀胱平滑肌细胞的行为和功能。它们可以用于研究膀胱活动的调控机制、平滑肌细胞的信号转导过程，以及平滑肌相关疾病的发生和发展机制。

此外，大鼠膀胱平滑肌细胞还被用作药物筛选的模型，以评估新药物对平滑肌细胞的影响和潜在的治疗作用。这些细胞也可以用于细胞治疗研究，如细胞移植和组织工程等，以修复受损的膀胱平滑肌组织或促进膀胱再生。

大鼠膀胱平滑肌细胞

大鼠膀胱平滑肌细胞培养操作

1)复苏大鼠膀胱平滑肌细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)大鼠膀胱平滑肌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)大鼠膀胱平滑肌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

大鼠膀胱平滑肌细胞可以用于细胞间接触在诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化中作用的实验研究

以SD大鼠为研究对象,分别利用密度梯度离心法和酶消化法,分离培养了BMSCs和BSMCs;模仿体内细胞生长的微环境,建立Rat Bladder Smooth Muscle Cells大鼠膀胱平滑肌细胞诱导BMSCs向SMCs分化的体外共培养模型,在共培养前后,检测膀胱平滑肌细胞诱导BMSCs的成肌分化标志蛋白表达变化;在共培养的基础上阻断细胞间缝隙连接,检测抑制细胞间连接后对BMSCs向SMCs分化情况的影响。

主要实验方法及结果如下:一、骨髓间充质干细胞和膀胱平滑肌细胞分离培养及鉴定1.无菌条件下取一月龄雌性SD大鼠双侧股骨,冲出骨髓,采用密度梯度离心法分离单个核细胞,DMEM-12培养,获得贴壁细胞,监测细胞生长曲线,流式细胞仪检测其免疫表型,采用不同条件培养基诱导细胞向成脂、成骨分化。和生长情况。

结果:分离的骨髓单核细胞培养后呈纺锤体样,其分子免疫表型为:CD44、CD90阳性;CD31、CD45阴性。在不同的诱导条件下,BMSCs可形成脂滴、骨结节结构,成功分离并培养了BMSCs。2.无菌条件下取一月龄雌性SD大鼠膀胱,采用胰酶消化法分离单个核细胞,HG-DMEM培养,获得贴壁细胞,监测细胞生长曲线,免疫荧光法鉴定其标志蛋白的表达。结果:平滑肌特异性的a-SMA,Calponin和SM-MHC表达阳性,证实分离并培养了膀胱平滑肌细胞。

二、大鼠膀胱平滑肌细胞向SMCs分化的体外共培养模型的建立与鉴定1.建立大鼠BSMCs诱导BMSCs向SMCs分化的体外共培养模型,在共培养前后,检测大鼠膀胱平滑肌细胞诱导BMSCs的成肌分化标志蛋白表达变化。以悬挂式细胞培养小室transwell底层的多孔膜(1um)作为BMSCs和BSMCs之间的间隔,细胞分泌的细胞因子,胶原等物质可通过膜上的孔相流通,多孔膜上下两面的细胞可通过膜上的孔进行细胞间接触,但细胞不能通过。将BMSCs和BSMCs分别接种于多孔膜两侧作为接触共培养实验组,将大鼠膀胱平滑肌细胞接种于多孔膜上,BSMCs接种于六孔板底,使得两种细胞仍处在一个培养环境中,之间距离<900μm,两种细胞分泌的细胞因子仍可以通过多孔膜膜孔相互影响,但是不发生接触作为非接触共培养实验组,以单独培养的BMSCs作为对照组,在共培养的第4天和第8天的免疫荧光法和Western blot法检测BMSCs中平滑肌特异性蛋白的表达情况,在共培养1,2,3天检测实验组中BMSCs的平滑肌特异性蛋白基因的表达情况。

结果:免疫荧光法、Western blot法和qRT-PCR均显示随共培养时间的延长,接触组的BMSCs中SMC特异的蛋白的表达量增加,而非接触组与共培养前无明显变化,提示细胞间的接触在诱导BMSCs向SMCs分化方面起了重要的作用。

2.正庚醇阻断细胞间缝隙连接对大鼠膀胱平滑肌细胞向SMCs分化的影响。初步实验证明细胞间接触共培养可以很好的诱导BMSCs向SMCs分化,正庚醇阻断缝隙连接后可以有明显的抑制BMSCs向SMCs分化,进一步证明缝隙连接在在诱导BMSCs向SMCs分化方面起了重要的作用。

参考文献

[1]Enabling stem cell therapies through synthetic stem cell-niche engineering[J].Peerani,Raheem;Zandstra,Peter W.Journal of Clinical Investigation,2010(1)

[2]In vitro Myogenic Differentiation of Human Bone Marrow–Derived Mesenchymal Stem Cells as a Potential Treatment for Urethral Sphincter Muscle Repair[J]..Annals of the New York Academy of Sciences,2009(1)

[3]Mimicking stem cell niches to increase stem cell expansion[J].Shara M Dellatore;;A Sofia Garcia;;William M Miller.Current Opinion in Biotechnology,2008(5)

[4]Stem Cells and Niches:Mechanisms That Promote Stem Cell Maintenance throughout Life[J].Sean J.Morrison;;Allan C.Spradling.Cell,2008(4)

[5]刘晓芳.细胞间接触在诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化中作用的实验研究[D].第三军医大学,2011.