驼科多克隆抗体制备

背景^[1-6]

驼科多克隆抗体系使用驼科（一般为羊驼和双峰驼）进行免疫，通过收集其抗血清来获得的抗体。驼科血清中的抗体，除常见的IgG1抗体，还有不与轻链连接，仅有重链部分的IgG2和IgG3亚型抗体。这两个亚型约占IgG抗体的50%，并利用唯一的一个可变结构域来与表位结合，因此也称为单域抗体。

驼科多克隆纳米抗体是一种由骆驼科动物体内重链抗体的可变区基因克隆得到的重组单域抗体,是目前已知的能与抗原结合的最小片段。其分子量小,结构简单,仅由重链可变区一个结构域组成,即可正常发挥抗体的功能。此外,经过人工改造的纳米抗体亲和力高于普通抗体,组织穿透力强,对人体的免疫原性弱,并且可以比较容易地进行改造和扩增,因此可以代替普通抗体,发挥更佳的作用。

驼科多克隆抗体制备步骤：

1. 免疫动物

1.1 客户提供抗原，纯度需>85%，浓度>0.5mg/mL，至少3mg；

1.2 免疫1只羊驼，共进行3次免疫；

1.3 采集1ml免疫前羊驼血清，作为阴性对照；

1.4 采集免疫后的多抗血清，进行ELISA效价检测试验；

1.5 提供ELISA检测报告和1ml免疫前羊驼血清。

2.采血

2.1.使用0.5mg抗原免疫羊驼；

2.2周后采血200-300ml；

3.纯化试验

3.1采集羊驼多抗血清，使用Protein A法纯化抗原（可选抗原亲和纯化，服务费会有相应调整）；

3.2提供纯化后多克隆抗体。

驼科多克隆抗体优点：

1.pM级的亲和性和高特异性

2.对各种抗原均有优秀的效果

3.可以识别区分转录后修饰（PTM）

4.可同时识别人类蛋白及其小鼠同源蛋白

5.适用于甲醛固定的免疫组化

应用^[7][8]

驼科多克隆抗体制备可用于乳腺癌的病理诊断：

用重组人Her2蛋白免疫羊驼,分离免疫后羊驼的淋巴细胞提取总RNA,利用PCR技术扩增羊驼Ig G的可变区（VHH）基因片段,构建噬菌体表面展示的纳米抗体文库,采用Her2抗原对文库进行亲和筛选,将筛选到的克隆转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达重组蛋白,镍离子亲和层析柱纯化获得纳米抗体并用ELISA技术和Biacore检测其与抗原Her2的亲和力,采用免疫组化方法检测Her2阳性乳腺癌组织中Her2的表达。

结果第二轮筛选后得到2个抗体H3和H5,ELISA结果显示两者都具有抗原结合活性,其中H5的亲和力达8.106×10-10mol/L。H5可识别乳腺癌组织中Her2抗原的表达。结论从Her2免疫的羊驼体内,通过噬菌体展示技术筛选获得了1个具有较高抗原结合活性的抗Her2纳米抗体,可用于乳腺癌的病理诊断。

参考文献

[1]Molecular imaging of tumors with nanobodies and antibodies:Timing and dosage are crucial factors for improved in vivo detection[J].Peter Bannas,Alexander Lenz,Valentin Kunick,Lennart Well,William Fumey,Bj?rn Rissiek,Friedrich Haag,Joanna Schmid,Kerstin Schütze,Anna Eichhoff,Martin Trepel,Gerhard Adam,Harald Ittrich,Friedrich Koch‐Nolte.Contrast Media Mol.Imaging.2015(5)

[2]Highly efficient production of VHH antibody fragments in Brevibacillus choshinensis expression system[J].Makoto Mizukami,Hiroko Tokunaga,Hiromasa Onishi,Yohei Ueno,Hiroshi Hanagata,Nobuo Miyazaki,Norihiko Kiyose,Yuji Ito,Matsujiro Ishibashi,Yoshihisa Hagihara,Tsutomu Arakawa,Akira Miyauchi,Masao Tokunaga.Protein Expression and Purification.2015

[3]Nanobody-based cancer therapy of solid tumors[J].Marta Kijanka,Bram Dorresteijn,Sabrina Oliveira,Paul MP van Bergen en Henegouwen.Nanomedicine(Lond.).2015(1)

[4]PAOO for Faster Function,Aesthetics and Harmony[J].Suchetha,Aghanashini,Lakshmi,Puzhankar,Prasad,Keshava B S,Akanksha,Garg,Apoorva,S M,Darshan,Mundinamane B.New York State Dental Journal.2014(5)

[5]Intraoperative fluorescence delineation of head and neck cancer with a fluorescent Anti‐epidermal growth factor receptor

nanobody[J].P.B.A.A.Driel,J.R.Vorst,F.P.R.Verbeek,S.Oliveira,T.J.A.Snoeks,S.Keereweer,B.Chan,M.C.Boonstra,J.V.Frangioni,P.M.P.Bergen en Henegouwen,A.L.Vahrmeijer,C.W.G.M.Lowik.Int.J.Cancer.2014(11)

[6]Dual-functioning phage-derived peptides encourage human bone marrow cell-specific attachment to mineralized biomaterials[J].Harsha Ramaraju,Sharon J.Miller,David H.Kohn.Connective Tissue Research.2014(S1)

[7]刘竞帆.羊驼来源的天然未免疫及免疫后纳米抗体文库的构建[D].中山大学,2017.

[8]王兰东,刘枫,成岩,李大磊,韩冰,张淑敏,冯东晓.抗人Her2抗原羊驼纳米抗体的筛选与鉴定[J].军事医学,2017,41(03):184-189.