免疫印迹实验--Western blotting的操作步骤

背景及概述^[1][2]

免疫印迹是几种相对分子质量不同的蛋白质先经SDS-PAGE凝胶电泳分离出不同的条带，再转印至硝酸纤维膜上，然后用酶标记的抗体对条带进行显色和鉴定。此法兼有SDS-PAGE的高分辨率和免疫反应的高特异性等优点，常用于检测不同基因所表达的各种微量蛋白质抗原。免疫印迹用于鉴定能够与特异性抗体相互作用的大分子抗原（一般为蛋白质）并测定抗原的大小。蛋白质首先通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再通过电泳转移到固相支持物上，固相支持物包括硝酸纤维素膜，聚偏乙烯二氟（PVDF）膜和阳离子尼龙膜等。首先把膜上未反应的位点封闭起来以抑制抗体的非特异性吸附，这样固定的蛋白即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作用。最后通过放射，生色或化学发光的方法进行定位。

实验常规试剂^[2]

1.  1.0 mol/L Tris•HCl （pH6.8）

2.  1.5 mol/L Tris•HCl（pH8.8）

3.  10% SDS

4.  10% 过硫酸胺（AP）

7.  还原型 5XSDS 上样缓冲液

8.  10X电泳液缓冲液

9.  10X转膜缓冲液

10. 1X转膜缓冲液

11. 10XTBS缓冲液

12. 1XTBST缓冲液

13. 封闭缓冲液: 1X TBST 含5% w/v 脱脂牛奶或者1X TBST 含2%-5%的牛血清白蛋白(BSA)。

14. 一抗/二抗稀释缓冲液: 常规稀释液使用的是含5% BSA 或5%脱脂牛奶的1X TBST，见一抗/二抗说明书；每种Elabscience®抗体都有固定的稀释比例。

操作步骤^[2]

1.根据待测蛋白分子量大小确定凝胶（分离胶）浓度制胶

2.上样使用适当的裂解液以及裂解方法裂解贴壁细胞、悬浮细胞或者组织样品。

3.跑胶： 浓缩胶推荐用 80 伏电压，待样品进入分离胶后，可用 120-180 伏。

4.跑胶完成以后，需先将胶上无样品的多余部分切除，滤纸和海绵需要预先润湿。

5.分离的多肽转移至膜载体上选择合适的膜

 转膜：以NC膜为例

提前十分钟到半小时用转膜 Buffer 润洗 NC 膜；按照以下的结构来安装转膜体系：负极-海绵-三层滤纸-胶-膜-两层滤纸-海绵-负极。

6.转膜，一般为 2 小时。

7.转完后将膜用1×丽春红染液染5 min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。 将膜晾干备用。

8.抗原检测

免疫印迹膜上非特异性蛋白质结合位点的封闭：

a. 转好的膜先用 TBST 润洗两次，每次五分钟。低速水平摇床，常温。

b. 用 5%的脱脂牛奶（TBST 配制）常温封闭一至两小时。封闭过程应在常温下置于转速较低的水平摇床。

抗体与抗原特异性结合：一抗孵育

9-11.用 TBST 洗膜三次，每次十分钟。

12. 常温下用二抗孵育一到两个小时。

13-15. 用 TBST 洗膜三次，每次十分钟。

16.准备 ECL 底物，对 8×5 cm 的膜，2毫升（1 毫升 A 加1 毫升 B）足够。将膜浸润底物中 1 分钟，然后取出，用滤纸吸掉膜上多余的底物。

17.用 x-ray 底片曝光，根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1 min或5 min，也可选择不同时间多次压片，以达效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。

参考文献

[1] 微生物学词典

[2] 免疫印迹实验--Western blotting技术说明书