大鼠心脏微血管内皮细胞

背景^[1-6]

大鼠心脏微血管内皮细胞分离自心脏组织；心脏是脊椎动物身体中最重要的一个器官，主要功能是为血液流动提供压力，把血液运行至身体各个部分。心脏由心肌构成，左心房、左心室、右心房、右心室四个腔组成。左右心房之间和左右心室之间均由间隔隔开，故互不相通，心房与心室之间有瓣膜（房室瓣），这些瓣膜使血液只能由心房流入心室，而不能倒流。

心脏的作用是推动血液流动，向器官、组织提供充足的血流量，以供应氧和各种营养物质，并带走代谢的终产物（如二氧化碳、无机盐、尿素和尿酸等），使细胞维持正常的代谢和功能。心脏微血管内皮细胞是组成心脏微血管腔面单层扁平上皮样细胞，它所产生和分泌的生物活性物质对维持血管张力、调节血压、抗血栓形成等有重要作用，在心脏血管疾病的发病机制中有重要病理生理学意义。

近年来大量研究表明，心肌微血管内皮细胞的功能和病理改变直接影响心肌细胞功能，也是诸多毒素、炎症因子及病毒等重要靶位，其作为体外研究的细胞模型在心肌缺血-再灌注发病机制和细胞间旁分泌细胞生长因子研究中起着重要作用。大鼠心脏微血管内皮细胞采用胶原酶-中性蛋白酶混合消化法结合密度梯度离心法、最后通过内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来，细胞总量约为5×10^5cells/瓶；细胞经CD31/vWF免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

大鼠心脏微血管内皮细胞原代培养：用1～4d sd大鼠全身经体积分数75%的酒精消毒后，仰卧位固定于无菌操作台上(以下步骤均为无菌操作。开胸，剥离心包膜，取心脏下1/3，置于盛有预冷(4℃pbs的小瓶中，洗尽血液，浸入体积分数70%的乙醇中10s以灭活心外膜和心内膜内皮细胞。预冷pbs冲洗，剪碎心肌组织，加入10倍体积的质量分数0.1%的胰蛋白酶，37℃消化5min。

轻轻吹打，静置1min后吸取上层液体(为分离出的内皮细胞(余下组织块用质量分数0.1%胰蛋白酶再消化5min，再收集上层液体用预冷的含体积分数15%小牛血清的培养基灭活残留胰酶活性。1000r/min，4℃离心10min收集细胞。将细胞重悬于含体积分数20%小牛血清m199培养基(内含100u/l青霉素、100mg链霉素、10mmol/l hepes、2mmol/l l_谷氨酰胺，200目筛网过滤，得到细胞混悬液，接种于培养瓶中，37℃培养30min以使成纤维细胞贴壁(重复此操作可提高细胞纯度。

转移细胞悬液，混匀后计数，根据实验目的不同，调整细胞密度至合适浓度，接种于培养瓶、96孔培养板或放有盖玻片的6孔培养板内(预先用质量分数1.5%的明胶处理，放入37℃，体积分数5%的co2培养箱中孵育6h，去除未粘附细胞，再放入m199(质量浓度50mg/l肝素、质量浓度15mg/l ecgs、体积分数20%的胎牛血清完全培养基中培养。co2培养箱37℃培养，24h后换液1次，以后每2～3d换液1次，直至长成细胞单层，用质量分数0.125%的胰蛋白酶消化备用。细胞存活率用锥虫蓝染色判断。

应用^[7][8]

大鼠脑微血管内皮细胞原代培养可用于：（1）血脑屏障的研究；（2）脑血管疾病的病理生理及分子生物学研究；（3）新药筛选；（4）脑微血管内皮细胞生理生化及药理学研究。

制备多组大鼠心脏微血管内皮细胞脂多糖损伤模型,通过显微镜对细胞形态进行观察,为后续实验提供形态学依据。探讨乌司他丁(UTI,Ulinastatin)预处理对LPS诱导损伤心肌微血管内皮细胞相关炎性反应的影响。

选取大鼠心肌组织,用PBS液洗除血液,同时对大鼠心脏细胞进行培养,直至长成细胞单层,选第3代内皮细胞,0.25%胰蛋白酶消化后将上述细胞分成6组:(1)空白对照组:加入无血清培养基;(2)模型组1:加入含0.01μg/mlLPS的无血清培养基作用24h;(3)模型组2:加入含0.1μg/mlLPS的无血清培养基作用24h;(4)模型组3:加入含1μg/mlLPS的无血清培养基作用24h;(5)模型组4:加入含10μg/ml LPS的无血清培养基作用24h;(6)模型组5:加入含100μg/mlLPS的无血清培养基作用24h。

在倒置显微镜下、扫描显微镜及透射显微镜下观察孵育前和孵育24h后内皮细胞形态学改变情况。对于大鼠心脏微血管内皮细胞脂多糖损伤模型进行继续培养干预:1)对照组不做任何处理;2)阿托法他汀(10000u/ml)预处理组;3)低浓度(5000u/ml)乌司他丁预处理组;4)中浓度(10000u/ml)乌司他丁预处理组;5)高浓度(20000u/ml)乌司他丁预处理组。

通过免疫组化以及Western blot等检测方法对处理前后各组细胞进行炎性因子检测,具体指标包括白细胞介素(IL-1)、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、细胞自噬相关蛋白Atg5,Beclinl和LC等在细胞内的表达情况;后期进行数据总结和分析;通过Western blot法检测各组内皮细胞中Bcl-2、bax蛋白表达水平的变化;MTT法检测各组细胞活力;流式技术检测各组细胞凋亡率。

参考文献

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