米伐木肽的制备

背景^[1]

米伐木肽，英文名为mifamurtide，分子式为C59H109N6O19P，主要用于治 疗非转移性可切除的骨肉瘤（少见但主要造成儿童和青年死亡的骨瘤），其 结构式如下：

米伐木肽

米伐木肽通过刺激诸如巨噬细胞等某些白细胞来杀灭肿瘤细胞。目前， 上市的米伐木肽注射剂制成球形脂质体，囊泡内是胞壁酰三肽（MTP）。此 脂质触发巨噬细胞去消耗米伐木肽。一旦消耗完米伐木肽，MTP刺激的巨噬 细胞，尤其是在肝、脾和肺内的巨噬细胞就会去寻找肿瘤并杀灭之。

米伐木肽注射剂获准上市基于Ⅲ期临床研究结果。台湾国立癌症研究所 （NCI）建立的协作组，由儿童肿瘤组（COG）进行研究，完成本品治疗骨肉 瘤研究课题在册的患者约800例。研究评价了米伐木肽与3-4种辅助化疗 药（顺铂、多柔比星、甲氨蝶呤、有或无异环磷酰胺）联合用药的结果。研 究显示，米伐木肽与化学药物联合使用可使死亡率降低约30%，78%经治疗 的患者存活长达6年以上。

目前，米伐木肽普遍依靠全液相合成，相关文献（Drugs Fut 1989,14,(3):220）公开了全液相合成米伐木肽的技术路线，但是采用全液相合 成的缺点在于合成中需要对中间体进行提纯，步骤繁琐、耗时较长，而且全 液相合成的总收率小于30%，这些问题一直是影响米伐木肽生产效率的主要 因素。

制备 ^[1]

1、式1化合物的合成

称取替代度为0.103mmol/g的Rink Amide-AM树脂20g，加入到固相反 应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，DBLK脱保护 6min+8min，DMF洗涤6次。称取2.45g(6mmol)Fmoc-D-Glu(OAllyl)-OH和 0.89g(6.6mmol)HOBT用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI 活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反 应终点（如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时）。

2、式2化合物的合成

反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，DMF 洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取1.9g(6mmol)Fmoc-L-Ala-OH和 0.89g(6.6mmol)HOBT用DMF溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI 活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反 应终点（如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时）。

3、式4化合物的合成

反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，用 DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取2.83g(6mmol)PNAM（式 3化合物）和0.89g(6.6mmol)HOBT用DMF溶解，冰水浴下加入1.2 mL(7.2mmol)DIPCDI活化3min后，，将混合液加入到反应柱中，室温反应2 小时，以茚三酮检测反应终点（如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则 延长反应1小时）。

4、式5化合物的合成

反应结束，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤树脂6次，加入60ml DCM 和3.2g(30mmol)苯硅烷反应3min后,加入0.6g(0.5mmol)四(三苯基膦)钯脱保 护30min，用DCM洗涤树脂6次。称取0.89g(6.6mmol)HOBT用DMF溶解， 冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI后，将混合液加入到反应柱中活化 3min后，加入0.77g(6mmol)H-Ala-OAllyl室温反应2小时。

5、式6化合物的合成

反应结束，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤树脂6次，加入60ml DCM 和12.6g(120mmol)苯硅烷反应3min后,加入0.6g(0.5mmol)四(三苯基膦)钯 脱保护30min，用DCM洗涤树脂6次。称取0.89g(6.6mmol)HOBT用DMF 溶解，冰水浴下加入1.2mL(7.2mmol)DIPCDI后，将混合液加入到反应柱中 活化3min后，加入4.15g(6mmol)PE（脑磷脂）室温反应2小时。

偶联结束，树脂收缩抽干，得到式6化合物22.12克，树脂增重率72.0%。

6、式7化合物的合成

将实施例2得到的式6化合物30.33克加入到500ml单口瓶中，加入预先 配置好的TFA：H2O=95:5（V:V）300ml，室温反应2小时，过滤树脂，收集 滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入3000ml冰乙醚\石 油醚(V:V=1:1)中沉淀。离心，石油醚洗涤5次，减压干燥得到式7化合物9.58 克，HPLC纯度83.6%。

7、全保护米伐木肽粗肽的制备

将得到的式6化合物9.45克加入到150ml单口瓶中，加入预先 配置好的TFA：H2O=95:5（V:V）95ml，室温反应2小时，过滤树脂，收集 滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入950ml冰乙醚\石 油醚(V:V=1:1)中沉淀。离心，石油醚洗涤5次，减压干燥得到式7化合物4.21 克，HPLC纯度91.7%。

8、米伐木肽的制备

将得到的粗肽溶液65ml,加入1000ml圆底烧瓶中，磁力搅拌下， 滴加650ml无水乙醚。滴加完毕，室温静置析晶。过滤，滤饼干燥后，将滤 饼再次溶于65ml甲醇。将此甲醇溶液加入1000ml圆底烧瓶中，磁力搅拌下， 滴加650ml无水乙醚。滴加完毕，室温静置析晶。过滤，滤饼真空干燥得到 米伐木肽5.62g,收率86.5%,纯度99.4%，总收率74.5%

主要参考资料

[1] 黄胜炎. (2009). 抗肿瘤药新品与研发进展. 上海医药, 30(9), 413-415.