NMY51感受态细胞的应用

背景^[1-6]

NMY51感受态细胞采用NMY51酵母菌株，可直接转化质粒进行蛋白互作验证或筛库试验；此菌株Transformation marker为：trp1，leu2-3，报告基因为：HIS3，ADE2和lacZ，步通过营养缺陷型报告基因(HIS3，ADE2)进行选择性生长筛选，进一步通过LacZ报告基因进行β-半乳糖分析显色的定量或半定量筛选，三个独立的报告基因，受不同启动子的调控，降低假阳性几率。

原理：泛素(ubiquitin)分子量很小，由76 aa残基组成；泛素作为降解信号分子，可以连接另外一种蛋白质的N端，然后被泛素专一性蛋白酶(UBPs)识别，从而导致与泛素相连的蛋白被酶解。泛素可以人为分成两部分：N端(Nub)，C端(Cub)。

首先，人为地将泛素Nub的3位异亮氨酸突变为甘氨酸(NubI突变为NubG)。这样与Cub的亲合力大大降低，避免了Cub和Nub自我结合或接近的可能性。其次，将Cub部分与人工合成的LexA-VP16转录激活因子融合成一个融合蛋白Cub-LexA-VP16。正常条件下NubG不与Cub结合，UBPs也不能识别分离的泛素，转录激活因子也不会被切下来。最后，将要检测的蛋白质分别与NubG和Cub融合，形成bait融合蛋(bait-cub-LexA-VP16)和prey融合蛋白(prey-NubG)。

如果bait和prey发生相互作用，就会促使NubG和Cub的相互接近，被UBPs识别，导致LexA-VP16的解离，进入核内，从而激活报告基因的转录。此系统可使用四种Bait质粒：pBT3-N，pBT3-SUC，pBT3-STE，pBT3-C，筛选标志均为LEU；三种Prey质粒：pPR3-C，pPR3-SUC，pPR3-STE，筛选标志均为TRP。

操作方法：

1.取100μl冰上融化的NMY51感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5μg，Carrier DNA(95-100度5min,快速冰浴，重复一次）10μl，PEG/LiAc 500μl并吸打几次混匀，30度水浴30 min(15 min时翻转6-8次混匀)。

2.将管放42℃水浴15 min(7.5 min时翻转6-8次混匀)。

3.5000 rpm离心40s弃上清，ddH2O 400μl重悬，离心30s弃上清。

4.ddH2O 50μl重悬，涂板，29℃培养48-96 h。

注意事项：

1.感受态细胞在冰上融化。

2.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3.同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。

4.NMY51酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。

5.菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole(AIR)在细胞中积累而使菌落变为粉红色。

6.酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90 h培养可见直径1 mm克隆。

应用^[7][8]

NMY51感受态细胞可用于脑心肌炎病毒衣壳蛋白与HuvEc相互作用蛋白的初步筛选：

脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)是一种单股正链无囊膜的RNA病毒,病毒的衣壳是由VP1、VP2、VP3及VP4四种结构蛋白组成,主要的抗原结构域位于VP1、VP2及VP3上,其中抗原性最强的为VP1。目前全世界EMCV流行的区域越来越广泛,且感染率呈逐年增长的趋势,但其侵染宿主的分子机制尚不明确。

本试验旨在通过酵母双杂交技术,筛选人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HuvEc)中与EMCV衣壳蛋白有相互作用的蛋白,并分析筛选到的目的蛋白在细胞中的定位、分子功能以及主要参与的生物学过程。本试验应用分裂-泛素酵母双杂交系统,构建EMCV衣壳蛋白VP1,VP2,VP3诱饵质粒,进行HuvEc细胞的cDNA文库筛选。通过6次酵母双杂交筛选试验,β-半乳糖苷酶分析去除阴性克隆,酵母回返实验去除假阳性克隆,初步筛选得到了57个有相互作用的蛋白。其中,与VP1互作的蛋白15个,与VP2互作的蛋白39个,VP3互作的蛋白3个。

BNIP3、C14orf1、SERP1、UBC、YIPF6与Bait VP1和VP2均互作;UBB与VP1,VP3均互作;SPCS1、ZUFSP与BaitVP1、VP2和VP3均互作。利用UniProtKB、PANTHER等生物信息学分析软件分析获知,筛选得到的互作蛋白主要分布在细胞质、细胞膜、细胞核、线粒体、高尔基体、内质网等一些细胞器中。这些蛋白的分子功能主要有催化活性、蛋白结合活性、分子结构活性、转运活性、翻译调节活性、通道调节活性等。主要参与的生物学过程有生物调节、细胞形成、细胞代谢、细胞增殖、细胞定位、转运及免疫反应等许多个过程。

参考文献

[1]Development of rapeseed with high erucic acid content by asymmetric somatic hybridization between Brassica napus and Crambe abyssinica.Wang YP,Sonntag K,Rudloff E.Theoretical and Applied Genetics.2003

[2]The method of cell fusion with the electric pulse.Zimmermann U.Biochimica et Biophysica Acta.1982

[3]Permeability changes induced by electric impulses in vesicular membranes.Neumann E,Rosenheck K.Journal of Membrane Biology.1972

[4]Electroporation in cells and tissues:A biophysical phenomenon due to electromagnetic fields.Weaver J C.Radio Science.1995

[5]Electroporation of cell membrane.Song T Y.Biophysical Journal.1991

[6]Medical Applications of Electroporation.Dev S B,Rabussary D P,Georg Widera,et al.IEEE Transactions on Plasma Science.2000

[7]Intergeneric hybridization of trichoderma reesei QM9414 and saccharomyces cerevisiae NCIM 3288 by protoplast fusion.Kumari J Anjani,Panda T.Enzyme and Microbial Technology.1994

[8]马玉梅.脑心肌炎病毒衣壳蛋白与HuvEc相互作用蛋白的初步筛选[D].西北民族大学,2017.